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HPLC-Tipps

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Die „kleinen“ im Sommer

Von Apparatur, Auto-Sampler, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Detektor, Fluss, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, polare Komponenten, Probengeber, Uncategorized, Veränderung der Peakfläche, Veränderung der Retentionszeit

Dieser Aktion folgt dieses Ergebnis – wieso eigentlich (I)? Leckage am UV-Detektor – was stelle ich fest? Doppeltes Injektionsvolumen – doppelte Peakfläche? Flussänderung – bleibt die Peakfläche konstant? Mehr Wasser im Eluenten ; eluieren die Peaks später, und wenn ja, warum? Wieso eluiert eine starke Base an einer stark belegten C18-Phase später als eine neutrale Komponente? Mehr Acetonitril im Eluenten, die Peaks eluieren früher; wird die Trennung schlechter?  Betätigen wir uns gerade ein wenig „sportlich“ und betrachten nun folgende Situationen: Jeder von uns macht in seinem (HPLC-) Alltag mechanisch Handgriffe, die richtig und dienlich sind; auch werden erwartete Ergebnisse als selbstverständlich angesehen –…

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16. Juni 2015

Das Totvolumen: Wie kritisch ist es wirklich? Und: Ist ein solches „schlimmer“ vor oder nach der Säule?

Von Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Gradient, HPLC-Tipps, Optimierung, Totvolumen

Der Fall Totvolumen ist das Volumen der Apparatur außerhalb der Säule in dem die Probe sich befindet; also, das Volumen vom Probengeber bis einschließlich Detektor – eben ohne Säule. Wir haben in unserer HPLC-Tipps-Reihe uns bereits mit dem Thema beschäftigt. Dennoch wird jenes insbesondere im Kontext mit Miniaturisierung und UHPLC weiterhin intensiv diskutiert, deswegen möchte ich es erneut aufgreifen. Wie wichtig, wie „schlimm“ ist das Totvolumen nun tatsächlich? Die Lösung Im aktuellen Tipp möchte ich wenig schreiben, dafür umso mehr Bilder zeigen. Merke direkt folgendes, was gleichzeitig bereits als Fazit der ganzen Diskussion gelten kann: Das Totvolumen ist wirklich wichtig…

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15. Mai 2015

Warum macht nur ein Peak Probleme? (II)

Von A Fehlersuche, Chromatogramm, Gradient, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Methodentransfer, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), pH-Wert des Eluenten, polare Komponenten, Systemeignungstest (SST), Veränderung der Peakfläche, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall In diesem HPLC-Tipp haben wir uns darüber unterhalten, dass bestimmte Komponenten durch Adhäsion an vielen Oberflächen ganz oder teilweise irreversibel haften bleiben können. Deswegen sollte man im Falle des Falles auch an unwichtig anmutende Änderungen oder Unterschiede in den Abläufen und in den Utensilien von Labor zu Labor denken. Heute wollen wir schauen, welche, eher chemische Ursachen infrage kommen, wenn eben nur ein Peak (oder auch zwei) im Chromatogramm Probleme bereitet(en). Die Lösung Vorweg: Vermutlich ist der pH-Wert oder – genauer – seine Veränderung die wichtigste Ursache für das hier besprochene Problem und hier wiederum dürften folgende zwei…

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20. April 2015

Warum macht nur ein Peak Probleme? (I)

Von A Fehlersuche, Apparatur, Auto-Sampler, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Probengeber, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Sie wenden eine Routinemethode an, alle Peaks im Chromatogramm verhalten sich wie von Ihnen erwartet: Die Retentionszeit bleibt konstant, die Peakfläche ebenso und die Peakform ist soweit OK. Nur ein (oder zwei) Peak(s) macht(en) Probleme, z. B: Nur dieser eine Peak ist breit und/oder seine Fläche ändert sich permanent und/oder evtl. ändert sich auch seine Retentionszeit. Was kann die Ursache sein? Die Lösung Wir beginnen mit dem, was nicht sein kann: Nachdem die übrigen Peaks sich „anständig“ verhalten, können wir alle Substanz-unspezifische Faktoren (die ja alle Peaks betreffen würden – mal stärker, mal schwächer, aber eben alle) ausschließen:…

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20. März 2015

Peaky und Chromy – die „HPLC-Versteher“? (die Antworten)

Von Apparatur, Auflösung, Detektor, HPLC-Tipps, kleine Peaks, Totvolumen, UHPLC und Miniaturisierung, Vorsäule, Z - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Herzlichen Glückwunsch an Dr. Marcus Hans! Marcus Hans hat die richtigen Antworten geliefert, seine kurzen Erklärungen sind sehr prägnant und werden nachfolgend nahezu wörtlich verwendet: Peaky meint: Das Totvolumen nach der Säule ist wichtiger als vor der Säule, ferner ist bei Gradiententrennungen das Totvolumen der Apparatur viel unwichtiger als das Verweilvolumen.Aussage ist korrekt; das Totvolumen nach der Säule ist viel wichtiger als jenes vor der Säule: So kann die Verbreiterung der Substanzbanden durch eine lange/dicke Kapillare, ein nicht richtig sitzendes Fitting oder ein großes Volumen der Messzelle die in der Säule erfolgte Trennung zunichte machen. Bei Gradiententrennungen dagegen ist das…

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20. Januar 2015

Peaky und Chromy – die „HPLC-Versteher“? (die Fragestellungen)

Von Apparatur, HPLC-Tipps, kleine Peaks, Totvolumen, UHPLC und Miniaturisierung, Vorsäule, Z - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Liebe Kolleginnen, liebe Kollegen möglicherweise fehlt auch Ihnen bei Diskussionsrunden schwer, Aussagen von Fachleuten zu beurteilen. Umso mehr, wenn sie sogar wahrhaftig erscheinen… Lasst uns nun zwei Fachleuten lauschen – sofern sie tatsächlich welche sind: Unseren Peaky und Chromy. Peaky fängt an – wie sollte es auch anders sein – aber Chromy will nicht zurückstecken und im Anschluss präsentiert auch er seine Aussagen. Wenn Sie möchten, überlegen Sie sich welche Aussagen richtig sind. Hier geht es zu den richtigen Antworten. Viel Erfolg! Peaky meint: Das Totvolumen nach der Säule ist wichtiger als vor der Säule, ferner ist bei Gradiententrennungen das…

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20. Dezember 2014

Wenn schon Druck, dann wenigstens so, dass es für Dich lohnt…

Von B Optimierung, Bodenzahl, HPLC-Tipps, Optimierung, UHPLC und Miniaturisierung, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall UHPLC-Anlagen erlauben hohe Drücke. Solche ergeben sich, wenn beispielsweise eine lange oder eine dünne Säule und/oder kleine Teilchen verwendet werden oder aber wenn bei niedrigen Temperaturen gearbeitet wird. Mit dünnen Säulen wird eine gute Massenempfindlichkeit erzielt, eine niedrige Temperatur ist oft hilfreich bei der Trennung von Enantiomeren oder Isomeren. Wenden wir uns zunächst dem Ziel, „besser trennen“, zu. Nehmen wir an, in einem gegebenen Fall ist eine Verbesserung der Auflösung über die Selektivität kaum möglich, da unsere Probe zwei sehr ähnliche Komponenten enthält. Hier ist eine Verbesserung der Auflösung nur über eine höhere Bodenzahl zu realisieren, eine solche…

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20. November 2014

Sinnvolle Säulentests abhängig von der Zielsetzung

Von Auflösung, Bodenzahl, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Lebensdauer der Säule, Stationäre Phase, Systemeignungstest (SST)

Der Fall Die wenigsten Anwender führen Säulentests durch – wenn doch, dann wird oft die Bodenzahl ermittelt, man interessiert sich für die Frage: „Ist die Säule noch „gut“?“. Die Mehrzahl führt eher einen Systemeignungstest (SST) durch, in diesem Fall ist die Säule ein Teil des „Gesamtsystems“. Dennoch kommen oft Fragen bzw. Zweifel auf, in etwa: „Reicht das, was wir machen?“ oder: „Wann ist die Säule nicht mehr zu gebrauchen?“ Mit diesen Fragen wollen wir uns hier beschäftigen. Die Lösung Säulentests können Informationen zu folgenden Attributen einer HPLC-Säule liefern: 1. Trennleistung (Sprich: Packungsqualität), 2. Eigenschaften der stationären Phase, 3. Selektivität/Eignung für…

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20. Oktober 2014

Die „Kleinen“ im Sommer

Von HPLC-Tipps, Peakverbreiterung, Totvolumen, Uncategorized

Resultierender Druck „Fuß“ am Peakende Core Shell (Fused Core)-Material Wann ergibt sich welcher Druck? Bei einer Änderung der Dimensionierung von Säulen bzw. Kapillaren sowie der Teilchengröße ändert sich der Druck. Nahezu alle Hersteller bieten EXCEL-Makros an, mit deren Hilfe der sich ergebende Druck bei einer Änderung von… rechnerisch ermittelt wird. Dennoch möchte ich hier gerne anhand einiger Zahlenbeispiele auf 1-2 Sachen hinweisen, um anschließend zu einem Resultat zu kommen. Merke: Der Druck verhält sich mit der Säulenlänge linear, mit dem Innendurchmesser der Säule sowie dem Teilchendurchmesser quadratisch und mit dem Innendurchmesser einer Kapillare in der vierten Potenz. Das heißt beispielsweise:…

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20. September 2014

Die „Kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, Detektor, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), pH-Wert des Eluenten, Spülen, Reinigen & Equilibrieren, Uncategorized, Verweilvolumen

„Dreck“ bzw. Matrix mal anders… „Dreck“ in einer HPLC-Anlage ist unangenehm, jener kann unterschiedlichen Ursprungs sein: Matrixbestandteile, Verunreinigungen aus der Probelösung oder dem Eluenten, Polymere aus dem Acetonitril, Kontaminationen aus dem Gerät etc. Eluiert der „Dreck“ einmalig oder unregelmäßig mit der mobilen Phase, lauten die üblichen Probleme: Geisterpeak(s), „Buckel“, „Wellen“, „Gebirge“ in der Basislinie, verstärktes Rauschen. Haftet er jedoch irreversibel oder auch länger an diversen Oberflächen wie Fritten, Injektionsnadel, Septum, Verbindungsstücke, „column saver“ (on-line Filter vor der Vorsäule) etc., müssen wir in diesem Fall mit einer weiteren Konsequenz rechnen: Memoryeffekt bzw. Retentionszeitverschiebung. Nachfolgend zwei Beispiele zur Retentionszeitverschiebung: In PV´ s…

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20. August 2014