0
Startseite » HPLC-Tipps-Datenbank » HPLC-Tipps Übersicht
A FehlersucheDetektorHPLC-TippsSpülen, Reinigen & Equilibrieren

Schmutz in der UV-Zelle eines Detektors

Der Fall Abhängig von der Konstitution der Probe und/oder Matrix kann Schmutz die Oberflä­che einer UV-Zelle belegen. Die Konsequenzen sind: Ein Teil der Lichtenergie geht „verloren“, und man erhält eine verrauschte Basislinie Durch die Schmutzschicht wird quasi die vorher glatte Oberfläche vergrößert. Dadurch wird die UV-Zelle zu einem Luftsammler, d.h. eventuell im Eluenten vorhan­dene kleine Luftbläschen werden dort festgehalten und wachsen zu einer größeren Luftblase, die sich durch „Spikes“, Rauschen und Basisliniendrift bzw. -versatz be­merkbar macht. Kurzum, Schmutz in der UV-Zelle bewirkt folgendes: Schlechtes Peak/Rauschen-Ver­hältnis, Spikes und Basislinienprobleme. Die Zelle muss gereinigt werden. Wie erfolgt nun dies am effektivsten? Die...
Um diesen Beitrag einsehen zu können, musst du eine der HPLC-Tipps Datenbanken Lizenzen erwerben.
sk
27. September 1996
ACNC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseGeisterpeaks & negative PeaksHPLC-TippsSpülen, Reinigen & Equilibrieren

Spülen einer HPLC-Anlage

Der Fall Spülen ist sicherlich eine der besten präventiven und kurativen Maßnahmen in der HPLC. Während für die meisten Anwender der Spülschritt bei einer Gradientenelution am Ende des Laufs einfach dazugehört, erfolgt bei isokratischen Trennungen ein solcher in der Regel erst bei Bedarf, was aus ökonomischen Gesichtspunkten auch richtig ist. Schauen wir uns doch an, an welchen Symptomen dieser „Bedarf“ erkannt wird, was die Ursachen sind und wie gespült werden sollte. Bemerkung: Einige der unten aufgeführten Symptome (z. B. Tailing, Änderung der Retentionszeit) können natürlich auch andere Ursachen haben. Die Lösung Tab. 1: Spülen einer HPLC-Anlage Das Fazit Mit sauberem...
Um diesen Beitrag einsehen zu können, musst du eine der HPLC-Tipps Datenbanken Lizenzen erwerben.
sk
27. August 1996
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsProbenlösungsmittel

Probenvorbereitung — wie kritisch sind welche Fehler?

Es gibt glückliche Anwender, die ihre Probe im Eluenten auflösen und direkt injizie­ren können. Wenn Sie zu diesen gehören und Sie noch einen isokratischen ACN/H2O-Lauf haben, können Sie recht getrost das Wort „Probenvorbereitung“ vorerst verges­sen. Es gibt wiederum Anwender, die aus Galle die Nebenkomponente eines metabolisierten Metaboliten quantifizieren müssen, und andere, die Heterocyclen mit Schwe­felatomen im Erdölrückstand des irakischen im Vergleich zum libyschen Erdöl auf­spüren müssen. Ihnen gehört unsere ganze Sympathie. Nachfolgend einige typische Fehlerquellen im Rahmen einer normalen Probenvorbereitung in tabellarischer Form. Tab. 1: Typische Fehlerquellen bei der Probenvorbereitung Lösen von Proben Herstellung von Eluenten Einige weitere beachtenswerte Punkte:...
Um diesen Beitrag einsehen zu können, musst du eine der HPLC-Tipps Datenbanken Lizenzen erwerben.
sk
27. Juli 1996
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsMethodenentwicklung, -Transfer und -OptimierungOptimierungRobustheit

Ist die vorliegende Methode eine robuste Methode?

Der Fall Die Kollegen aus der Entwicklung schicken Ihnen eine Methode oder der Chef kommt triumphierend in das Labor mit der Kopie einer Methode in der Hand und sagt: „Machen Sie mal.“ Oder Sie bekommen den neuesten Prospekt der Firma Fanta­siechrom GmbH mit der Abbildung eines Chromatogramms samt Methode, die Sie gut gebrauchen können. Bevor Sie irgend etwas Chromatographisches anfangen, wür­de ich Ihnen dringend empfehlen, die Methode bei einer Tasse Kaffee/Tee etwas genauer anse­hen. Die Lösung Bei einigen Methoden weiß man/frau von Anfang an, dass sie kaum robust sein können. Wenn Sie dennoch die Methode übernehmen müssen, sollten Sie wenigstens...
Um diesen Beitrag einsehen zu können, musst du eine der HPLC-Tipps Datenbanken Lizenzen erwerben.
sk
26. Juni 1996
ApparaturC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-Tipps

Wie wähle ich meine HPLC-Anlage bzw. meinen HPLC-Lieferanten aus?

Der Fall Vielleicht haben Sie demnächst beim Kauf einer Anlage zu entscheiden, welches Ge­rät gekauft wird, oder Sie sollen für den Chef die Entscheidung vorbereiten. Auch für erfahrene Anwender kann dies bei der aktuellen Anzahl von Herstellern und Gerätetypen zu einem großen Problem werden. Welche Fragen sollten Sie im Vorfeld für sich abklären? Die Lösung Wir gehen in dem konkreten Fall davon aus, dass die Entscheidung für die HPLC als die geeignete Methode für Ihr Trennproblem richtig ist – nicht immer eine triviale Entscheidung. Man sollte bei dem Kauf sowohl Kriterien allgemeiner Natur als auch wissenschaftlich-technische Forderungen berücksichtigen. Zu den...
Um diesen Beitrag einsehen zu können, musst du eine der HPLC-Tipps Datenbanken Lizenzen erwerben.
sk
26. Mai 1996
AuflösungB OptimierungBodenzahlHPLC-TippsLebensdauer der SäuleOptimierungpolare KomponentenVeränderung der RetentionszeitVeränderung des Chromatogramms

Wie kritisch sind Temperaturschwankungen/Temperaturveränderungen? Teil II: Säule, Trennung

Der Fall Durch eine Änderung der Trenntemperatur ändern sich die chromatographischen Grö­ßen sowohl in physikalischer (Δ Viskosität => Δ Kinetik => Δ Effizienz) als auch in chemischer/thermodynamischer Hinsicht: Δ Sorptionsenthalpie => Δ Retentionszeit => Δ Selektivität. Somit ist die Temperatur ein chromatographischer Parameter, mit dem die Trennung gezielt verändert werden kann. Wie ist nun der Parameter „Tem­peratur“ konkret zur Trennungsoptimierung einzusetzen? Die Lösung Eine Temperaturerhöhung bewirkt folgendes: Chemie Die Retentionszeit nimmt stets ab (einige chirale Trennungen stellen seltene Ausnahmen dar). Diese Abnahme verläuft für unterschiedliche Substanzen ungleich­mäßig. Somit haben wir eine Änderung der Selektivität. Diese ist z. B. stark ausge­prägt...
Um diesen Beitrag einsehen zu können, musst du eine der HPLC-Tipps Datenbanken Lizenzen erwerben.
sk
26. April 1996
A FehlersucheHPLC-TippsVeränderung der RetentionszeitVeränderung des Chromatogramms

Wie kritisch sind Temperaturschwankungen/Temperatureränderungen? Teil I: Allgemeines, Detektor

Teil I: Allgemeines, Detektor Der Fall Die Temperatur hat eine direkte Einwirkung auf das chromatographische Ergebnis, da sie … die Wechselwirkung Probe ↔ stationäre Phase, die Viskosität des Eluenten und das Auflösen des Kieselgels … beeinflusst. Ferner kann sich bei erhöhter Temperatur manche Substanz zersetzen. Schließlich machen sich Temperaturschwankungen in der Detektorzelle im Chromatogramm von sehr stark (elektrochemischer Detektor) bis „nur“ ärgerlich (UV-Detektor) bemerkbar. Schauen wir uns hier das Problem eher allgemein von seiner technischen Seite her an. In diesem HPLC-Tipp wird uns der Komplex „Temperatur-Trennung“ beschäftigen. Die Lösung Ohne „Wenn und Aber“ gilt folgendes: Eine konstante Temperatur erhöht die Robust­heit...
Um diesen Beitrag einsehen zu können, musst du eine der HPLC-Tipps Datenbanken Lizenzen erwerben.
sk
22. März 1996
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsInjektionsvolumenPeakverbreiterung

Maximal zulässiges Injektionsvolumen ?

Der Fall Durch die Art der Probenvorbereitung erhalten Sie eine stark verdünnte Probelösung oder Sie haben mit der Nachweisgrenze zu kämpfen, jedenfalls würden Sie gerne aus bestimmten Gründen ein relativ großes Probevolumen direkt injizieren. Wie groß darf dieses Volumen sein, ohne dass Sie sich dadurch eine merkliche Peakverbreiterung einhandeln? Wir setzen voraus, dass die Säule nicht überladen ist; hier ist also die Rede von einer evtl. Peakverbreiterung nur aufgrund der Injektion. Die Lösung Man kann über die Varianten der einzelnen Beiträge zur Peakverbreiterung das zuläs­sige Injektionsvolumen ausrechnen. Das ist möglich, da wir in der HPLC stochastisch unabhängige Prozesse haben. Nur...
Um diesen Beitrag einsehen zu können, musst du eine der HPLC-Tipps Datenbanken Lizenzen erwerben.
sk
22. Februar 1996
A FehlersucheApparaturAuto-SamplerHPLC-TippsProbengeberVeränderung der Peakfläche

Injektion von Substanzen aus wäßrigen Lösungen

Der Fall Angenommen, Sie arbeiten mit Wasser als Probelösungsmittel. Wenn Sie bei konstant injizierter Probemenge unterschiedliche Peakflächen erhalten sollten, könnte dies an der teilweise irreversiblen Sorption Ihrer Substanz an einer „rauhen“ Oberfläche im HPLC-System liegen. Die Lösung Die irreversible Sorption vor allem von höhermolekularen Substanzen (z. B. Polyzuckern, Proteinen) an Stahl- oder Glasoberflächen oder am Dichtungsmaterial ist ein bekanntes Problem. Wenn die Probe in reinem Wasser aufgelöst ist, können derartige Oberflächen sich wie schwache stationäre Phasen (apolare Pseudophasen) verhalten, an denen eine geringe Menge der Probe sorbiert wird (Physisorption, Adhäsion). Sie kann ihrerseits nun bis zur Erschöpfung ihrer Kapazität weiteres...
Um diesen Beitrag einsehen zu können, musst du eine der HPLC-Tipps Datenbanken Lizenzen erwerben.
sk
22. Januar 1996
ApparaturC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsInjektionsvolumen

Wie teste ich eine HPLC-Anlage und auch die einzelnen Mo­dule?

Der Fall Eine elementare Voraussetzung für eine richtige und präzise Analytik ist eine gut funktionierende Meßapparatur. Die einfachste und sicherste Methode zu deren Überprüfung ist die zweifache Injek­tion einer bekannten Probe, Standard- oder Kontrollprobe. Sind die erhaltenen Chromatogramme identisch mit einem Chromatogramm, das Sie bei einem einwandfreien Zustand der Anlage, z. B. nach einer Wartung, erhalten haben, bedarf es ei­gentlich keiner weiteren Überprüfung. Als Vergleichskriterien eignen sich: Retentionszeit, Peakfläche und -höhe, Asymmetriefaktor. Abweichungen, die noch zu ak­zeptieren sind, sind genau festzulegen. Gibt es solche, muss der aktuelle Zustand der HPLC-Module überprüft werden. Wel­che Tests eigenen sich dafür? Die Lösung Tab....
Um diesen Beitrag einsehen zu können, musst du eine der HPLC-Tipps Datenbanken Lizenzen erwerben.
sk
22. Dezember 1995
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseFlussHPLC-TippsVeränderung der PeakflächeVeränderung der Retentionszeit

Arbeitet die Pumpe richtig, präzise oder genau?

Der Fall Hier geht es nicht um Haarspalterei und diese Frage ist auch nicht als netter „Gag“ gedacht. Erst das Wissen um Genauigkeit, Richtigkeit und vor allem um Präzision einer Pumpe gibt Gewißheit über die Aussagekraft eines quantitativen Ergebnisses. Was bedeutet nun präzise und richtig in diesem Zusammenhang und wie werden diese Kenndaten ermittelt? Die Lösung Die Kenndaten werden durch einen Test bestimmt. Der Pumpentest besteht aus zwei Teilen. Pumpenrichtigkeit Mittels einer Stoppuhr und eines Meßzylinders/Meßkolben wird die Richtigkeit der Volumen­förderung überprüft (Messung am besten nach der Säule): Die Frage ist, fördert die Pumpe z. B. die gewünschten l ml/min...
Um diesen Beitrag einsehen zu können, musst du eine der HPLC-Tipps Datenbanken Lizenzen erwerben.
sk
22. November 1995
ApparaturC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsMethodenentwicklung, -Transfer und -OptimierungMethodentransferVeränderung des ChromatogrammsVerweilvolumen

Übernahme einer Gradientenmethode – der Einfluss der Appa­ratur

Der Fall Ein klassischer Fall: Sie übernehmen eine Gradientenmethode und, obwohl Sie pein­lichst auf Einhaltung aller chromatographischen Bedingungen achten, erhalten Sie mit Ihrer Anlage ein anderes Chromatogramm. Warum? Die Lösung Fast immer liegt der Grund in den unterschiedlichen Verweilvolumina (Verzögerungs­volumina, Delay Volume oder Dwell Volume) einmal Ihrer Anlage und zum anderen der Anlage, mit der die Methode entwickelt wurde. Als Verweilvolumen wird das Volumen vom Ort der Mischung der zwei Eluenten (Mischventil, Mischkammer, T-Stück) bis zur Säule be­zeichnet. Dieses kann je nach Hersteller von ein paar hundert Mikrolitern bis zu mehreren ml betragen! Die Hochdruckgradienten haben im Vergleich zu den...
Um diesen Beitrag einsehen zu können, musst du eine der HPLC-Tipps Datenbanken Lizenzen erwerben.
sk
22. Oktober 1995
ApparaturC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsMethodentransferPeakverbreiterungTotvolumen

Was sagt mir das Totvolumen einer isokratischen Anlage?

Der Fall Sicherlich haben Sie vom Totvolumen („extra column volume“) einer HPLC-Anlage gehört. Wenn Sie zu den AnwenderInnen gehören, die dieses gemessen und es ,,im Griff“ haben, brauchen Sie nicht weiter zu lesen, gehen Sie einfach zu einem nächsten HPLC-Tipp. Dieser HPLC-Tipp wendet sich an Leser, die der Meinung sind, dass nur TheoretikerInnen und ,,Supergenaue“ sich dafür interessieren sollten. Sie selbst möchten nur eine gute Trennung und haben für solche Spielchen keine Zeit. Ich stimme mit Ihnen völlig überein. Das was zählt, ist in der Tat die Trennung. Doch das Totvolumen beeinflusst sie, bei früh eluierenden Peaks und im isokratischen...
Um diesen Beitrag einsehen zu können, musst du eine der HPLC-Tipps Datenbanken Lizenzen erwerben.
sk
21. September 1995
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsLebensdauer der Säule

Wie stark sollte der Puffer sein?

Der Fall Puffer sind bei der Trennung von ionischen Substanzen wichtig: Oft ist erst durch einen bestimmten, konstant zu haltenden pH-Wert (deswegen der Puffer) die gewünschte Selektivität und Reproduzierbarkeit zu erreichen. So weit, so gut. Mal übernimmt man nun eine Methode, in der der Eluent 5 mMol stark ist, bei der nächsten Methode ist die Rede von 100- oder sogar 150-mMol-Lösungen, und manchmal weiß man es einfach nicht, wie bei folgendem Beispiel: ,,Man wiege so viel mg von Salz X und gebe so viel ml an Säure Y oder Base Z zu!“ Wie kritisch ist die Pufferstärke jetzt wirklich und...
Um diesen Beitrag einsehen zu können, musst du eine der HPLC-Tipps Datenbanken Lizenzen erwerben.
sk
21. August 1995
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsLebensdauer der Säule

Der pH-Wert meines Eluenten ist zu hoch/zu niedrig, was ist zu tun?

Der Fall Nehmen wir an, Sie haben festgestellt, dass für Ihre Probe die beste Trennung mit einer C18-Säule bei pH = 9,5 zu erzielen ist. Das ist zwar prima, doch Ihre Säule ist von diesem hohen pH-Wert wahrscheinlich nicht sonderlich begeistert (ab pH ≈ 8 löst sich Kieselgel auf). Die Säulenqualität würde schnell nachlassen. Natürlich könnte man nach einer geeigneteren Säule suchen, z. B. einer Hybridsäule oder einer auf Polymer- bzw. Aluminiumoxidbasis usw. Doch die Umstellung kostet Zeit und Geld, oder schlicht und ergreifend: Sie dürfen keine andere Säule verwenden! Eine Vorsäule könnte die Lösung sein. Manchmal wird jedoch nach...
Um diesen Beitrag einsehen zu können, musst du eine der HPLC-Tipps Datenbanken Lizenzen erwerben.
sk
21. Juli 1995
ACNC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseEluentHPLC-Tipps

Methanol oder Acetonitril?

Der Fall ACN/H2O- und MeOH/H2O-Gemische sind die häufigsten Eluenten in der RP-HPLC. Kann es eine Präferenz geben? Was ist nun besser: ACN oder MeOH? Die Lösung Natürlich gibt es keine allgemeingültige Antwort, spezielle Selektivitätsunterschiede können sehr wichtig sein. Beispielsweise können einerseits bei bestimmten Substanzklassen Methanolate entstehen und ACN stabilisiert andererseits oktaedrische Cu2+-, Cd2+- und Zn2+-Komplexe. Nachfolgend werden einige generelle Unterschiede der zwei Lösungsmittel gegenübergestellt. Tab. 1: Vergleich zwischen Acetonitril und Methanol Das Fazit Offensichtlich sind die Vorteile von ACN den meisten Anwendern wichtiger als seine Nachteile, es wird in ca. 70 % der RP-Trennungen eingesetzt. Siehe auch Tipp „Methanol vs....
Um diesen Beitrag einsehen zu können, musst du eine der HPLC-Tipps Datenbanken Lizenzen erwerben.
sk
21. Juni 1995
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-Tipps

Wie entgase ich meinen Eluenten am besten?

Der Fall Unruhige Basislinie, starkes Rauschen und Druckschwankungen sind u. a. Hinweise dafür, dass Sie Ihren Eluenten überhaupt bzw. noch besser entgasen sollten. Wann ist dieser Schritt notwendig? Die Lösung Nachfolgend ist die Effektivität der vier wichtigsten Entgasungsmethoden für ein polares (Abb. 1. links, MeOH) und ein unpolares (Abb. 1 rechts, Hexan) Lösungsmittel dargestellt. Abb. 1: Effektivität von Entgasungsmethoden für ein polares (MeOH) und ein unpolares (Hexan) Lösungsmittel. (Quelle; J. W. Dolan, L. R. Snyder, Troubleshooting LC Systems, Human Press, 1989 Dazu folgende Bemerkungen: Auskochen ist nicht praktikabel Entgasung mittels Vakuum ist eine gute Methode. Sie erfolgt oft in einem...
Um diesen Beitrag einsehen zu können, musst du eine der HPLC-Tipps Datenbanken Lizenzen erwerben.
sk
21. Mai 1995
ACNC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsSpülen, Reinigen & Equilibrieren

Wie entferne ich organische Verunreinigungen schnell von einer RP-Phase?

Der Fall Stark organische Substanzen (Lipide, große Moleküle etc.) können an RP-Phasen, insbesondere C18, regelrecht ,,kleben“ bleiben. Das Ergebnis ist manchmal ein hoher Rückdruck und fast immer eine Verschlechterung der Trennung. Es kann zu der Bildung von breiten und tailenden Peaks oder auch Geisterpeaks kommen. Man müsste also mit MeOH oder ACN spülen. Das bedarf aber eines gewissen Aufwands und die Zeit ist oft knapp. Was tun? Die Lösung Injizieren Sie 100 μl oder 200 μl MeOH oder ACN. (Überprüfen Sie vorher, ob durch die ACN-Injektion in pufferhaltigen Eluenten kein Niederschlag entsteht!). Sollten sich organische Substanzen an der RP-Oberfläche befinden,...
Um diesen Beitrag einsehen zu können, musst du eine der HPLC-Tipps Datenbanken Lizenzen erwerben.
sk
21. April 1995
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseChromatogrammHPLC-TippsStationäre PhaseVeränderung des Chromatogramms

Warum kann ich polare Substanzen an der einen C18-Säule ver­nünftig trennen und an der anderen kaum?

Der Fall Sie möchten polare Substanzen mittels RP-Chromatographie trennen. Nehmen wir an, es handelt sich dabei um Säuren, und Sie möchten mehrere Säulen auf ihre Eignung testen. Natürlich machen Sie es richtig und wählen „gute“ Kandidaten, d. h. nachsilanisierte Phasen.* Trotz Ihrer überlegten Wahl erhalten Sie bei gleichen chro­matographischen Bedingungen (Eluent, pH-Wert, Temperatur etc.) mit einer Säule vernünftige Chromatogramme, während eine zweite, ebenfalls nachsilanisierte („endcappede“) Säule tailende Peaks liefert. Warum? *Anmerkung: Nachsilanisierte C18-Phasen sind geeignet zur Trennung von polaren Substanzen – jedenfalls was die Peakform betrifft … Das Kiesel­gel wurde nach der Umsetzung mit dem C18-Alkylsilan, zur Herstellung der RP-Phase,...
Um diesen Beitrag einsehen zu können, musst du eine der HPLC-Tipps Datenbanken Lizenzen erwerben.
sk
19. März 1995
B OptimierungHPLC-TippsNicht berücksichtigenSäuleSäulenauswahl

Ist diese C18-Säule für meine Probe prinzipiell geeignet?

Der Fall Bei der Vielzahl an C18-Säulen heute auf dem Markt wäre es unökonomisch, die eine oder andere C18-Säule bei einer neuen Fragestellung auf „gut Glück“ auszutesten. Wenn tatsächlich keinerlei Informationen vorliegen, sollte man versuchen, die Auswahl einzuengen. Dazu gibt es einige Regeln. Die Lösung Folgende Substanzeigenschaften der Probe sind für die ersten Entscheidungen hilfreich: Löslichkeitsverhalten Chemische Natur Molekulargewicht Zunächst sollte entschieden werden, ob für Ihre Probe eine C18-Säule auf Kiesgelba­sis in einem klassischen RP-System grundsätzlich in Frage kommt. Anschließend können bestimmte Säulen anhand der Substanzeigenschaften aussortiert werden, und andere wiederum sollten als Kandidaten im Auge behalten werden. Tab. 2.1:...
Um diesen Beitrag einsehen zu können, musst du eine der HPLC-Tipps Datenbanken Lizenzen erwerben.
sk
19. Februar 1995