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A FehlersucheGeisterpeaks & negative PeaksHPLC-TippsPeakverbreiterungpolare KomponentenSpülen, Reinigen & EquilibrierenTotvolumenUncategorizedVeränderung des Chromatogramms

Die „Kleinen“ im Sommer

Peaks eluieren früher und ihre Peakbreite hat zugenommen – eine mögliche Ursache: Wir gehen davon aus, dass weder die Packungsqualität noch eine Verschiebung des pH-Wertes als Ursache infrage kommt. Der Grund könnte u.a. Schmutz an der Oberfläche der stationären Phase sein. Tritt dieser Fall ein, so ist ein Teil der aktiven Zentren belegt, die Wechselwirkungen nehmen ab, die Peaks eluieren früher. Ferner führt die geringer gewordene Zahl der aktiven Zentren, die für eine Wechselwirkung mit den zu trennenden Komponenten nun zur Verfügung stehen, zu einer lokalen Überladung der Säule. Das ist die Ursache für die Peakverbreiterung. Auf der Seite der...
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20. Juli 2014
BehältnisseC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseGeisterpeaks & negative PeaksGradientHPLC-TippspH-Wert des EluentenUncategorizedVeränderung der Peakfläche

Die „Kleinen“ im Sommer

  Ein paar Unterschiede zwischen isokratischen und Gradientenläufen Änderung der Peakform und der Peakfläche durch ungewollte Änderung des pH-Wertes Wiederfindung abhängig von der (Glas)Oberfläche In diesem Tipp haben wir bereits einige Unterschiede zwischen isokratischen und Gradiententrennungen besprochen,  auch hier wurde das Thema behandelt. Nun, weiter unten einige Weitere: Retentionszeit bei isokratischen Läufen: Halbe Säulenlänge oder doppelter Fluss: Abnahme der Retentionszeit um Faktor 2 Retentionszeit bei Gradienten-Läufen: Halbe Säulenlänge oder doppelter Fluss: Natürlich ebenso Abnahme der Retentionszeit, allerdings abhängig von mehreren Faktoren lediglich um ca. 10-30% Und überhaupt: Die Retentionszeit wird bei Gradientenläufen vom Start- und End % B sowie von...
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20. Juni 2014
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsMethodenentwicklung, -Transfer und -OptimierungUHPLC und Miniaturisierung

Benutze deine UHPLC in diesen Fällen lieber nicht als UHPLC…

Der Fall Die LC-Anlage von heute ist eine UHPLC. Die UHPLC hat zweifelsohne Vorteile; so sind beispielsweise Anwender zufrieden ob der kurzen Läufe, der „guten“ Trennungen und des geringen Lösemittelverbrauchs. Möchte man nun seine UHPLC wirklich unter UHPLC-Bedingungen betreiben (z. B. 100 mm, 2,1 mm, ≤ 2 µm, Druck ≥ 700-800 bar) so gibt es Fälle, in denen man es lieber nicht machen sollte. Tut man es doch, so sind Probleme zwangsläufig vorprogrammiert. Welche Fälle wären das? Die Lösung Es gibt eine Reihe von Situationen, in denen Trennungen unter HPLC-Bedingungen sinnvoller als unter UHPLC-Bedingungen sind. Ich greife willkürlich vier Fälle...
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20. Mai 2014
B OptimierungChromatogrammHPLC-TippsPeaks vor - oder nahe - der TotzeitpH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels)polare KomponentenProbenlösungsmittelVorsäule

Trennung von polaren Analyten in der RP-HPLC

Der Fall Nehmen wir an, Ihre Peaks, die ab ca. der 3-fachen Totzeit eluieren (also ab einem Retentionsfaktor von k = 3, was genügend starke Wechselwirkungen bedeutet), werden ordentlich getrennt. Kopfzerbrechen bereiten Ihnen eher die polaren Komponenten, die direkt nach der Totzeit eluieren – ihre Trennung sei dürftig. Verständlicherweise möchten Sie ungerne gleich die gesamte Methode verändern. Was wäre nun zu tun? Die Lösung Für die Verbesserung der Trennung von polaren Komponenten in der RP-HPLC könnte man sich einen 3-Stufen-Plan mit zunehmendem Aufwand vorstellen: Einfache Maßnahmen – Manipulation (im positiven Sinne!) der Probelösung – Probelösung polarer machen, um eine „On...
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20. April 2014
AuflösungC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseChromatogrammEluentGradientHPLC-TippsLösungsmittelVeränderung des ChromatogrammsVerweilvolumen

Unterschiede zwischen isokratischen und Gradientenläufen (2)

Der Fall Ca. 70-80% der RP-Trennungen in der Routine sind Gradientenläufe. Den meisten Anwendern sind die Vorteile der Gradientelution geläufig, so z. B: Trennung von polaren und apolaren Komponenten in einem Lauf, merklich kürzere Trenndauer im Vergleich zu isokratischen Läufen, Erniedrigung der Bestimmungsgrenze und nicht zuletzt: Ein Übersichtsgradient ist ein hervorragender erster Schritt bei der Methodenentwicklung einer unbekannten Probe. Was ist nun bei Gradiententrennungen grundsätzlich „anders“ im Vergleich zu isokratischen Trennungen? Die Lösung Isokratische und Gradiententrennungen stellen zwar keine gänzlich andere Welten dar, gibt es doch einige entscheidende Unterschiede. Nachfolgend greife ich stellvertretend zwei Unterschiede heraus. Interessierten Lesern sei auf...
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20. März 2014
B OptimierungGradientHPLC-Tippspolare Komponenten

Ungewöhnlich aber erfolgreich…

Der Fall Zwischen den Jahren habe ich einen Nebenraum meines Büros aufgeräumt. Wie oft in solchen Fällen fand ich manches Interessante, u. a. auch längst vergessene Messungen. Beim Durchblättern der verstaubten Ordner ist mit folgendes abermals bewusst geworden: Früher hat man auch ungewöhnliche Sachen einfach ausprobiert – auch als „normale(r)“ Anwender(in), nicht nur als forschender Mensch. Die Angst des Scheiterns war früher nicht so stark wie heute, von der zur Verfügung stehenden Zeit gar nicht zu sprechen… Ich gebe Ihnen nachfolgend vier Beispiele. Die Lösung 1. Ionen werden üblicherweise an schwache Ionenaustauscher getrennt, die IC ist seit längerem eine gut...
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20. Januar 2014
ApparaturB OptimierungDetektorHPLC-TippsLC-MS-KopplungZ - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Ein HPLC-Tag in einem Entwicklungslabor kurz vor Weihnachten 2035…

Liebe Kolleginnen, liebe Kollegen, lasst uns für einen Moment zurücklehnen und einen Dezember-Tag des Jahres 2035 in einem HPLC-Entwicklungslabor vorstellen. Wie könnte er aussehen? Nachfolgend eine mögliche Variante. Doch zunächst ein Blick auf die im Jahre 2035 herrschende Nomenklatur: Die aus der Vergangenheit bekannte Trenntechnik HPLC bzw. UHPLC heißt seit ca. 6-8 Jahren – also seit Ende der 2020er Jahre – HRLC („High Resolution Liquid Chromatography“). Man hat der Methode nach langem Zögern endlich das Attribut gegeben, das sie tatsächlich charakterisiert: Bei einer Trenntechnik steht die Auflösung („Resolution“) im Vordergrund; Die „Bodenturner“, vor allem diejenigen der Geräte-/Säulen-Anbieter, haben sich zwar...
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24. Dezember 2013
ApparaturAuflösungC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseGradientHPLC-TippsMethodentransferPeakverbreiterungTotvolumenVeränderung des ChromatogrammsVerweilvolumen

Totzeit, Totvolumen, Verweilvolumen

Der Fall Wir haben uns bereits über die Bedeutung dieser Begriffe sowie deren Einfluss auf die Trennung unterhalten, nur: In meinen Seminaren stelle ich häufig fest, dass diese Größen uneinheitlich, teilweise auch falsch benutzt werden. Auch ihr Einfluss auf die Trennung wird unter- oder überschätzt. Lasst uns diese Dinge noch einmal definieren, die „alten“ Leser mögen diese Wiederholung mir nachsehen. Die Lösung Vorbemerkung Aus praktischer Sicht gilt natürlich folgendes: Wenn diese Begriffe anders als hier definiert, benutzt werden und alle Beteiligte das gleiche darunter verstehen, gibt es selbstverständlich absolut keinen Handlungsbedarf. Nun zu den Definitionen: Totzeit oder Mobilzeit („dead time“,...
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24. November 2013
A FehlersucheDoppelpeaksHPLC-TippsInjektionsvolumenLösungsmittelPeakverbreiterungpH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels)ProbenlösungsmittelVeränderung der PeakflächeVeränderung des Chromatogramms

Der Einfluss des Probelösungsmittels auf das Chromatogramm

Der Fall Ist die Probelösung nicht identisch mit der mobilen Phase (bzw. mit der Anfangszusammensetzung vom Eluent A bei der Gradientelution) kann dies einen Einfluss auf das Chromatogramm haben. Wie macht sich das nun genau bemerkbar? Die Lösung Halten wir zunächst wie folgt fest: „Andere“ Probelösung kann vielerlei bedeuten: Andere Zusammensetzung, anderes organisches Lösungsmittel, anderer pH-Wert, andere Pufferstärke/anderes Salz etc. Konzentrieren wir uns auf die RP-Chromatographie und betrachten folgende drei Fälle: Die Probelösung kann polarer, apolarer oder einfach „anders“ als der (Anfangs-)Eluent sein. 1. Polarer – also im Sinne der RP-Chromatographie schwächer Diese Situation sollte stets angestrebt werden, denn: Wenn...
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24. Oktober 2013
BodenzahlC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseEinstellparameterHPLC-TippsIntegrationSystemeignungstest (SST)Variationskoeffizient (Vk)Veränderung der Peakfläche

Systemeignungstest – Sinn und Kriterien

Der Fall Der Systemeignungstest („System Suitability Test“, SST) ist ein wichtiges, gleichauf sensibles Thema speziell im regulierten Umfeld. Ein Blick in der Alltagspraxis zeigt, dass bzgl. SST unterschiedliche Auffassungen herrschen betreffend Sinn, Häufigkeit und Kriterien. In diesem Tipp möchte ich dazu einige Hinweise und Anregungen geben. Die Lösung Zunächst ein paar Worte zum Sinn eines SST. Halten wir zunächst folgendes fest: In den Monographien steht „expressis verbis“, dass ein derartiger Test die Apparatur, die Proben, die Methode und die „electronics“ (sprich: Datenerfassung und – verarbeitung, d.h. einschließlich Reportdaten wie Peakfläche) umfassen soll. Das bedeutet, Ziel eines SST ist die Überprüfung...
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24. September 2013
A FehlersucheApparaturHPLC-TippsUncategorizedVariationskoeffizient (Vk)Veränderung der Peakfläche

Die „Kleinen“ im Sommer

Degasser Große Variationskoeffizienten Vorsicht beim Degasser! Degasser sind praktisch. Nichtdestotrotz sollte man an bestimmte Sachen denken: Die Effektivität des Entgasens ist abhängig vom Fluss, je geringer der Fluss, umso besser arbeitet ein Degasser Schläuche zum Ersten: Die Schläuche werden mit der Zeit porös – vor allem, wenn häufig mit Puffer gearbeitet wird. Betrachten Sie bitte die Schläuche/Membrane als Verschleißteile, je nach verwendeter mobiler Phase sollten sie alle 3-4 Jahre evtl. ausgewechselt werden Schläuche zum Zweiten: Haben Sie trotz gründlichem Spülen ein Problem mit Geisterpeaks? Es kann sein, dass dies mit den Schläuchen im Degasser zusammen hängt. Nicht nur wg. Weichmacher...
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24. August 2013
A FehlersucheGeisterpeaks & negative PeaksHPLC-TippsUncategorized

Die „Kleinen“ im Sommer

Schmale und breite Peaks während eines Gradientenlaufs Luft entfernen Bessere Wiederfindungsrate Stärkeres Rauschen oder Geisterpeaks immer um 17.00 Uhr oder nur „gestern“… 1. Schmale und breite Peaks während eines Gradientenlaufs Bekanntlich sehen die Peaks beim Gradienten normalerweise schön aus: Schmal, symmetrisch, im Idealfall bleibt die Peakbreite bei allen Peaks konstant. Nehmen wir jetzt an, Sie fahren einen Gradienten im HILIC-Modus. An einigen Bereichen des Chromatogramms sehen die Peaks gut aus, an einigen Bereichen wiederum erhalten Sie breite Peaks. Mögliche Erklärung: je nach aktueller Eluentenzusammensetzung, die in diesem Moment die Säule erreicht, kann bei der Wechselwirkung der Substanz(en) mit den funktionellen...
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24. Juni 2013
A FehlersucheApparaturAuto-SamplerHPLC-TippsProbengeberRobustheitVeränderung der Peakfläche

Der Probengeber als Ursache für mangelnde Reproduzierbarkeit der Peakfläche

Der Fall In diesem Tipp haben wir uns über Probleme betreffend den Detektor unterhalten. Hier wollen wir uns anschauen, welche typische Autosampler-Probleme zu einer schlechten Reproduzierbarkeit und/oder falschen Peakfläche führen können. Die Lösung Einige Probleme beeinträchtigen typischerweise die Reproduzierbarkeit der Injektion, d.h. der Vk ist beispielsweise bei einer 6-fachen Injektion aus einem vial nicht zufriedenstellend. Hier wäre als Ursache eine zu schnelle Ansauggeschwindigkeit („Aspiration Rate“ oder „Aspiration Time“) im Falle von viskosen Probelösungen zu nennen, merke: Auch Wasser/Puffer als Probelösung ist recht viskos! Andere Ursachen wiederum führen zu einer falschen Peakfläche. Die irreversible Adsorption an der Nadel wäre ein Beispiel...
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24. Mai 2013
A FehlersucheApparaturDetektorHPLC-Tippskleine PeaksVeränderung der Peakfläche

Der Detektor als Ursache für mangelnde Reproduzierbarkeit der Peakfläche

Der Fall Nehmen wir an, Sie haben folgendes Problem: Sie stellen bei Wiederholmessungen eine schlechte Reproduzierbarkeit der Peakflläche fest oder Sie erhalten bei der Methodenübernahme/dem Methodentransfer einfach eine andere Peakfläche als vorgegeben. Sie können mehrere mögliche Ursachen ausschließen (Autosampler, Stabilität der Probe, Fluss, Memory-Effekt etc.). Es scheint also, dass der Detektor das Problem ist. Woran könnte es nun liegen? Die Lösung Gehen wir davon aus, dass Sie selbstverständliche Sachen überprüft haben bzw. bei Bedarf die wichtigsten Maßnahmen bereits ergriffen haben, z. B: Das Gerät ist natürlich qualifiziert, die Lampenenergie ist OK, die Kalibriergerade mit einer SST-Lösung sieht gut aus, die...
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24. April 2013
A FehlersucheACNEluentHPLC-TippsLösungsmittelWasser

Einsatz von HPLC-Lösungsmitteln – wieso gibt es trotz „HPLC-Qualität“ Probleme?

Der Fall Selbstverständlich verwenden wir alle Lösungsmittel mit ausgewiesener HPLC-Qualität. Dennoch gibt es immer wieder im Alltag Probleme mit ihnen – was sind die wichtigsten Ursachen dafür? Die Lösung Halten wir zunächst wie folgt fest: In einem HPLC-Labor können Lösungsmittel mit folgenden Qualitätssiegel u.a. zum Einsatz kommen: „HPLC-Grade“, „Gradient-Grade“, „UHPLC-Grade“, „zur Spektroskopie“. Die unterschiedlichen Bezeichnungen suggerieren eine unterschiedliche Reinheit per se, was jedoch nicht immer der Fall ist: So liegt manchmal der Unterschied zwischen „Gradient-Grade“ und „zur Spektroskopie“ in den zusätzlichen Prüfungen auf Reinheit und zwischen „HPLC-Grade“ und „UHPLC-Grade“ nur in dem zusätzlichen Filtrieren über 0,2 µm-Filter – der Herstellungsprozess...
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25. Februar 2013
ACNBodenzahlGradientHPLC-Tippspolare KomponentenZ - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Peaky und Chromy im Gespräch – die Lösung

Liebe HPLC-Anwenderinnen, liebe HPLC-Anwender, In diesem Tipp berichtete ich vom Dialog der zwei Peaks Peaky und Chromy. Nachfolgend zur Erinnerung noch einmal das Gespräch und anschließend die richtige Antworten mit kurzer Kommentierung. Peaky Säure und Chromy von Kieselhausen im Gespräch Peaky: Hör mal Chromy, du bist so groß und mächtig, und hast so´n großes Molekulargewicht und viele funktionelle Gruppen und überhaupt… Dich muss man doch entweder bei kleinen Wellenlängen messen, weil deine viele funktionellen Gruppen dort gut absorbieren oder aber im Interface, weiß´te, da, bei der LC/MS-Kopplung, dich richtig kaputt machen, um dich detektieren zu können – Mensch, bist du...
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25. Januar 2013
ACNBodenzahlGradientHPLC-TippsZ - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Peaky und Chromy im Gespräch…

Liebe HPLC-Anwenderinnen, liebe HPLC-Anwender, ab und an tauchen die zwei Peaks, Peaky und Chromy, auf – aus dem nichts.  So auch diesmal und da ich zufällig unmittelbar bei in der Nähe stand, habe ich ungewollt ihr Gespräch gelauscht. Wie immer ging´s um ihr Leben in der Säule – und an diesem Tag waren sie irgendwie recht streitlustig. Das ist zwar nicht ganz höflich, aber ich möchte Ihnen ihren Dialog trotzdem nicht vorenthalten. Peaky Säure und Chromy von Kieselhausen im Gespräch Peaky: Hör mal Chromy, du bist so groß und mächtig, und hast so´n großes Molekulargewicht und viele funktionelle Gruppen und...
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25. Dezember 2012
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseChromatogrammGradientHPLC-TippsIntegrationSpülen, Reinigen & Equilibrieren

Peaks auf einer Flanke – mögliche Konsequenzen und Maßnahmen

Der Fall Manch´ ein Peak eluiert auf einer Flanke. Die Flanke kann u.a. ein abfallender Gradient, ein sehr langsam eluierender Peak oder einfach Matrix sein. Angenommen, das Problem ist chromatographisch nicht zu lösen, wie könnte man vorgehen, um den Fehler bei der Bestimmung der Peakfläche zu minimieren? Die Lösung Im Falle vom Gradienten haben wir an dieser Stelle bereits darüber gesprochen, wie eine Lösung aussehen könnte: Blindgradient bzw. das Chromatogramm einer Matrixinjektion (Matrixlösung ohne Probe) vom Original-Chromatogramm abziehen und das Differenz-Chromatogramm integrieren. Hier möchte ich kurz auf zwei etwas anders gelagerte Fälle eingehen. Fall 1 In Abb. 1 sind sechs...
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25. November 2012
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseChromatogrammDetektorHPLC-TippsLC-MS-KopplungVeränderung der PeakflächeVeränderung des Chromatogramms

Fluss, Peakhöhe und Peakfläche

Der Fall Wenn der Fluss sich ändert, ändert sich auch die Peakform – mal stärker, mal schwächer. So weit so gut. Was machen nun die Peakhöhe und die Peakfläche? Ändern sie sich ebenso und wenn ja, ist dies merklich? Was wären schließlich die Konsequenzen? Die Lösung Es muss grundsätzlich zwischen Konzentrations- und Massen-empfindlichen Detektoren unterschieden werden: Der UV- (UV-Vis, DAD) und der Fluoreszenzdetektor beispielsweise sind Konzentrations-empfindliche Detektoren, der Massendetektor bei der LC/MS- bzw. LC/MS/MS-Kopplung ein Massen-empfindlicher Detektor. D.h. im ersten Fall ist das Signal von der Konzentration, im Zweiten von der Masse der Analyten abhängig. Bei einem Konzentrations-empfindlichen Detektor verändert...
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25. Oktober 2012
AuflösungC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseChromatogrammHPLC-Tipps

Die Auflösung – verschiedene Formeln, verschiedene Ergebnisse

Der Fall Die Auflösung ist – vereinfacht gesagt – der Abstand zwischen zweier Peaks an der Basislinie. Sie hängt von der absoluten Stärke der Wechselwirkungen der zwei Komponenten (Kapazität, Retentionsfaktor k), von dem Verhältnis der Wechselwirkungen der zwei Komponenten (Selektivität, Selektivitäts- oder Trennfaktor α) und von der Peakform (Effizienz, Bodenzahl N) ab. Die Auflösung wird als das wichtigste Kriterium für die „Güte“ einer Trennung angesehen. So wird oft eine Mindestauflösung verlangt, auch werden Auflösungen zum Methodenvergleich heran gezogen. Es ist nun so, dass es mehrere Formeln für die Auflösung gibt, die alle mehr oder weniger benutzt werden. Es liegt somit auf...
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25. September 2012