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Einstellparameter

Die kleine Frage zur Validierung …

Von Allgemein, Einstellparameter, Monatstipp, Nachweisgrenze

„Wir haben bei der Bestimmung vom LOQ starke Schwankungen. Auch an unterschiedlichen Geräten und mit neuen Säulen. Woran kann das liegen? Als LOQ-Kriterium haben wir wie üblich ein S/N-Verhältnis von 10:1.“

Antwort:
Die Erfahrung zeigt, dass hier mit recht großen Integrationsfehlern zu rechnen ist.
Wir konnten zeigen (s. Infos am Ende des Beitrages), dass kaum eine kommerzielle Software in der Lage ist, bei automatischer Integration und einem S/N-Verhältnis von 10:1 so zu integrieren, dass der Fehler – bei optimalen (!) Bedingungen (BL-Trennung, kaum Drift usw.) – nicht mindestens 5-10 % beträgt. Siehe dazu weiter unten die Werte in der Tabelle für den ersten, kleinen Peak (oben): In den grau schraffierten Feldern befinden sich Werte mit einer Abweichung von mehr als 1 % vom richtigen Wert, bedingt durch eine fehlerhafte Integration.

 

Einige Kommentare und Erläuterungen zu den Werten der Tabelle:

  • Die verwendeten Einstellparameter („Settings“) wie Dwell-Time, Time Constant, Sample Rate usw. können – vor allem bei kleinen Peaks – die Integration beeinflussen. So ist beispielsweise die Abweichung vom richtigen Wert beim ersten Peak bei einem Threshold-Wert von 50 12,50 %, bei einem Threshold-Wert von 100 17,78 % (EZChrom)
  • Bei einigen Software-Programmen können unterschiedliche Integrationsalgorithmen angewandt werden. Die erhaltenen Ergebnisse können dabei recht stark abweichen, siehe z. B. die Werte der zwei Spalten bei Empower und Chromeleon (Waters, Dionex/Thermo). Das betrifft nicht nur absolute Abweichungen, es können sich sogar sowohl Unter- als auch Überbefunde ergeben
  • Erst ab einem S/N-Verhältnis von ca. 50:1 ist bei allen kommerziellen CDS (Chromatography-Data-Systems) der Integrationsfehler merklich kleiner 1 %

Fazit bzgl. Richtigkeit – wenn das Ziel zuverlässige Ergebnisse lautet:
– Bei symmetrischen, BL-getrennten Peaks liegt der Fehler durch die Integration erst
ab einem S/N-Verhältnis von ca. 50:1 gesichert unter 1 %
– Bei tailenden, Nicht-BL-getrennten Peaks – evtl. noch auf einer driftenden Basislinie –
ist ein S/N-Verhältnis von ca. 100:1 empfehlenswert.

Auch die Reproduzierbarkeit der Integration bei mehrfacher Injektion (Präzision) lässt bei einem S/N-Verhältnis von 10:1 oft zu wünschen übrig.

Empfehlung bzgl. Reproduzierbarkeit von Ergebnissen am LOQ:
Injizieren Sie sechs Mal eine reale Probe und ermitteln bei einem S/N-Verhältnis von 10:1 den Variationskoeffizienten (VK, RSD, Relative Standard Deviation). Frage: Genügt der resultierende VK bei diesen chromatographischen Bedingungen an dieser Apparatur und bei diesen Settings Ihren Anforderungen? Wenn nicht, wäre das S/N-Verhältnis so lange zu erhöhen, bis dies der Fall ist. Diese Konzentration kann dann als gesichert reproduzierbares LOQ (Limit Of Quantification, Bestimmungsgrenze) angesehen werden, die Vergleichbarkeit der Ergebnisse wäre somit gegeben: Ihre Software kann bei dieser Konzentration reproduzierbar integrieren. Ein möglicher systematischer Fehler („Unrichtigkeit“ der Peakfläche und somit des Gehaltes) bleibt natürlich unerkannt, siehe dazu weiter oben „Richtigkeit“.
Merke:
Das in einigen regulierten Bereichen (FDA, ICH etc.) etablierte S/N-Verhältnis von 10:1 als Kriterium für LOQ basiert auf Richtlinien, es sind keine unverrückbare/gesetzliche Vorgaben: Es handelt sich ja um „Guidelines“ und nicht um „Regulation“/“Legal Requirements“. Es zeigt sich, dass mit Begründung ein größeres S/N-Verhältnis als Kriterium für LOQ von Auditoren/Inspektoren durchaus akzeptiert wird.

Weiterführende Infos und Angebote zum Thema „Validierung“: Artikel, Dokumente, Definitionen, Beratung, Bücher, Kurse

1. September 2025

Ist dieser HPLC-Peak „sauber“? Einfache Tests zur Prüfung der Peakhomogenität

Von Auflösung, B Optimierung, Chromatogramm, Einstellparameter, Jahrestipps, LC-MS-Kopplung, Nachweisgrenze, Optimierung, polare Komponenten, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Im HPLC-Tipp vom letzten Dezember war Peaky am Zweifeln, ob er es wirklich ist: „Bin ich überhaupt der Peaky? Und wenn ja, wieso fühlt es sich so an, als wäre ich mehrere …“ Es geht also um die Frage, ob ein Peak homogen ist oder womöglich doch eine Koelution vorliegt. Im vorliegenden HPLC-Tipp werden wir uns einfache Tests anschauen, die recht schnell durchzuführen sind: Keine Änderung der chromatographischen Parameter, keine Änderung der Apparatur. In den nächsten HPLC-Tipps werden wir uns sukzessiv mit aufwendigeren Methoden beschäftigen. Die Lösung Eine Veränderung von Einstellparameter („Settings“) kann helfen, innerhalb von Sekunden/Minuten die Peakhomogenität zu überprüfen. Es lohnt sich (auch) an solche „banale“, schnelle Möglichkeiten zu denken: Injektion bei einer anderen (niedrigeren) Wellenlänge, siehe Abbildung 1: Bei 271 nm erscheint der dritte Peak als ein Peak (unteres Chromatogramm), bei 225 nm sind zwei Peaks zu erkennen (oberes Chromatogramm)   2. Eine große Zeitkonstante („Filter Response“, „Filter Time Constant“) führt zwar zu einer ruhigeren Basislinie, die Peakbreite nimmt allerdings zu, man verliert an Auflösung. Folgendes Zahlenbeispiel aus einer „Technical Note“ von Waters, die freundlicherweise von Sascha Schifrin zur Verfügung gestellt wurde: Kein digitales Filtern: Auflösung (Resolution) 3,16, Peakkapazität 16 Zeitkonstante, 0,5 Min: Auflösung 1,82,…

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19. Februar 2025

Zwei identische Anlagen, isokratischer Lauf, unterschiedliche Ergebnisse – mögliche Ursachen

Von A Fehlersuche, Apparatur, Einstellparameter, HPLC-Tipps, Lebensdauer der Säule, Peakverbreiterung, Totvolumen

Der Fall Sie übernehmen eine isokratische HPLC-Methode; Ihre Anlage ist baugleich mit der Anlage an der die Methode entwickelt worden ist, die Prüfvorschrift ist recht ausführlich. Dennoch gibt es Probleme, z. B. Retentionszeit(en), Peakform- und/oder -fläche ist(sind) unterschiedlich, ferner: Die Säule hält nicht so lang. Was können die Ursachen sein? Die Lösung Erwartungsgemäß gibt es viele mögliche Gründe. Jene können u.a. grob in zwei Kategorien eingeteilt werden: 1. Es fehlen Details zum Handling bzw. zum Gerät 2. Unterschiede in der Handhabung apparativer „Feinheiten“ Nachfolgend werden einige typische Beispiele für beide Kategorien aufgeführt. Fehlende Detailangaben in der Prüfvorschrift/Methodenbeschreibung ∆ Integrationsalgorithmus, ∆…

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31. März 2022

Regulierter Bereich, feststehende Prüfvorschrift, geforderte Auflösung wird nicht erreicht – was ist möglich?

Von Apparatur, Auflösung, B Optimierung, Bodenzahl, Einstellparameter, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Optimierung, Probenlösungsmittel, Totvolumen, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Sie arbeiten in einem regulierten Bereich und sind an strenge Prüfvorschriften gebunden. In einer solchen lautet die Forderung: „Auflösung R größer 1,5“, aber gerade diesen Wert erreichen Sie aktuell nicht. Welche regel-konforme Handgriffe kämen in Frage? Die Lösung Was möglich ist, hängt letzten Endes davon ab, wie genau die Angaben in der betreffenden PV sind. Ist in der Tat restlos alles – von der Eluentenzusammensetzung bis zu den Einstellungen („Settings“) – vorgegeben, so können Sie de facto es nur mit einer neuen Säule versuchen. Ist die PV etwas „weicher“, d.h. es sind nur die wichtigsten Parameter wie Säule,…

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3. Mai 2020

Andauernde Probleme beim Methodentransfer? Ein Reisegrund…

Von A Fehlersuche, Apparatur, Einstellparameter, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Methodentransfer, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Eine Methode wird transferiert. Trotz idealen Voraussetzungen, das wären beispielsweise identische Hard- und Software in den beteiligten Labors, qualifizierte Geräte, vorhandenes Know-how der AnwenderInnen hier und dort usw. sind die Ergebnisse alles andere als zufriedenstellend. Die auftretenden Probleme können vielfältiger Natur sein: Starkes Basislinie-Rauschen, Verschiebung der Retentionszeit, mangelnde Reproduzierbarkeit der Peakflächen etc. Mehrere E-Mails oder auch Video-Valls bringen keine wirkliche Lösung. Was ist zu tun? Die Lösung Gleich zu Beginn meine Empfehlung: Handelt es sich um eine wichtige Methode und ist das Problem nach drei bis vier E-Mails/Video-Calls nicht zu lösen? Fahren/fliegen Sie hin. „Sie“ ist der/die Anwender(in)…

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3. Mai 2019

Wie kann ich einen Peak „schöner“ machen?

Von Apparatur, B Optimierung, Bodenzahl, Einstellparameter, Gradient, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Optimierung, Probenlösungsmittel, Totvolumen

Der Fall Ein oder mehrere Peaks ist/sind klein und breit. Wie kann ich schnell die Peakform verbessern? Das Thema haben wir in ähnlicher Form bereits behandelt. Die Frage wird jedoch von AnwenderInnen recht häufig gestellt, ich kann gerne noch einmal darauf eingehen. Die Lösung Nachfolgende Vorschläge zielen auf typische RP-Systeme: Schnelle Maßnahmen, Zeitbedarf bis ca. 15-20 min Probelösung mit Wasser und/oder mit Kochsalz/Puffer versetzen und – wenn erlaubt – mehr injizieren, ansonsten Injektionsvolumen konstant lassen Säule umdrehen – nicht bei UHPLC-Säulen und auch nicht beim Gradienten: Evtl. vorhandene Hohlräume am Säulenkopf, die eine Verschlechterung der Peakform bedeuten, befinden sich nun…

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1. März 2019

Die „Kleinen“ im Sommer…

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Einstellparameter, HPLC-Tipps, Integration, Uncategorized

Temperatur, Einstellparameter Im Sommer beschäftigen wir uns ja traditionsgemäß mit kleinen Tipps. Als erstes, passend zur Jahreszeit, ein paar Bemerkungen zur Temperatur. Alsdann folgen zwei Beispiele die zeigen, dass bei Unkenntnis der Einstellparameter einer übernommenen Methode und Verwendung von anderen Zahlenwerten man evtl. keine übereinstimmenden Ergebnisse erhält. Das kann viel Zeit und Nerven bei Methodentransfers kosten. Es lohnt sich daher, gegenüber solchen Dingen ein wenig Sensibilität zu entwickeln. Temperatur Wir gehen davon aus, dass zwei Säulenöfen technisch in Ordnung sind, sie wurden vor kurzem qualifiziert. Bei gleicher Temperaturanzeige kann es dennoch zu unterschiedlichen Chromatogrammen kommen wenn das Funktionsprinzip der zwei…

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17. Juli 2018

Sehr kleine Peaks – was kann ich tun?

Von B Optimierung, Einstellparameter, HPLC-Tipps, kleine Peaks

Der Fall Nehmen wir an, Sie müssen Komponenten in einer extrem geringen Konzentration quantifizieren – die Peaks sind einfach sehr klein. Es geht also im vorliegenden Fall vordergründlich nicht um eine gute Auflösung, es geht um eine gute Detektierbarkeit. Leider stehen Ihnen weder ein FLD noch eine LC/MS zur Verfügung, Sie müssen mit einem DAD arbeiten. Nehmen wir ferner an, es handelt sich um eine Gradientenmethode. Welche Möglichkeiten gibt es nun, einigermaßen auswertbare Peaks zu erhalten? Die Lösung Nachfolgend stichwortartig einige Lösungswege: Kleines Säulenvolumen: Möglichst kurze und dünne Säulen, z. B. 30-50 x 2,1 mm Möglichst schwache Probelösung, die Peakform…

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17. März 2018

Der HPLC-Tipp im Januar: „Denksport“ – die Lösungen

Von Einstellparameter, HPLC-Tipps, Z - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Liebe Leserinnen, liebe Leser, im Dezember habe ich Ihnen etwas HPLC-Denksport angeboten… Heute wollen wir uns anschauen, was nun die richtige Lösung ist. Von welchem Parameter/Charakteristikum eines DAD´s wird die Empfindlichkeit  nicht beeinflusst? Bandbreite („Bandwidth“) Spalt („Slit“) Datenrateaufnahme („Sample Rate“) Wellenlänge Rauschen Sie wird von allen beeinflusst; als Beispiel wird in Abb. 1 gezeigt, dass bei einer Bandwidth von 1,2 nm das Rauschen der Basislinie stärker ist als bei 12 nm. Somit ändert sich das Peak/Rauschen-Verhältnis und folglich auch die Empfindlichkeit. In Abb. 2 sieht man, dass bei einem Spalt von 16 nm mehr Licht auf die Moleküle in der…

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16. Januar 2018

Systemeignungstest – Sinn und Kriterien

Von Bodenzahl, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Einstellparameter, HPLC-Tipps, Integration, Systemeignungstest (SST), Variationskoeffizient (Vk), Veränderung der Peakfläche

Der Fall Der Systemeignungstest („System Suitability Test“, SST) ist ein wichtiges, gleichauf sensibles Thema speziell im regulierten Umfeld. Ein Blick in der Alltagspraxis zeigt, dass bzgl. SST unterschiedliche Auffassungen herrschen betreffend Sinn, Häufigkeit und Kriterien. In diesem Tipp möchte ich dazu einige Hinweise und Anregungen geben. Die Lösung Zunächst ein paar Worte zum Sinn eines SST. Halten wir zunächst folgendes fest: In den Monographien steht „expressis verbis“, dass ein derartiger Test die Apparatur, die Proben, die Methode und die „electronics“ (sprich: Datenerfassung und – verarbeitung, d.h. einschließlich Reportdaten wie Peakfläche) umfassen soll. Das bedeutet, Ziel eines SST ist die Überprüfung…

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24. September 2013