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A FehlersucheGeisterpeaks & negative PeaksHPLC-TippsProbe

Das kann mit der Probe in der Säule passieren

Der Fall Kieselgel ist ein sehr guter Feststoffkatalysator, er wird vielfach in der chemischen Industrie eingesetzt. In der RP-Chromatographie nun, wo ja Kieselgel die mit Abstand wichtigste Matrix darstellt, führt seine Umsetzung mit Silanen aufgrund von sterischen Effekten zu einem Umsetzungsgrad von lediglich ca. 50-70%. Das bedeutet, dass RP-stationäre Phasen eine „nackte“ Kieselgeloberfläche von immerhin ca. 30-50% aufweisen können. Die katalytische Wirkung von Kieselgel kann dazu führen, dass manch eine Substanz in der Säule chemisch verändert wird. Das Ergebnis: Peaks, die im Chromatogramm erscheinen, könnten Substanzen sein, die in der Säule durch die katalytische Wirkung des Kieselgels entstanden sind und...
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27. April 2010
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-Tippspolare KomponentenStationäre Phase

HILIC und Co… oder: HILIC ist nicht gleich HILIC!

Der Fall Die Trennung von stark polaren Komponenten mittels HPLC stellt oft eine echte Herausforderung dar. Nachfolgend stichwortartig einige Möglichkeiten: RP-Modus Wasseranteil sowie Salzkonzentration im Eluenten erhöhen (z. B. bis 90%, bei bestimmten stationären Phasen bis 95-100% Wasser/Puffer möglich). Dadurch wird der Eluent sehr polar und die Analyte – die ja stets eine erhöhte Hydrophobie im Vergleich zum polaren Eluenten aufweisen – werden zu hydrophoben Wechselwirkungen mit der stationären Phase „gezwungen“. PH-Wert verändern bzw. – wenn es denn unbedingt sein muss… – Ionenpaarreagenzien verwenden. Dadurch wird eine saure/basische Komponente neutralisiert bzw. maskiert, auch hier ist das Ergebnis die Verstärkung von neutralen/hydrophoben...
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29. März 2010
ApparaturC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseGeisterpeaks & negative PeaksHPLC-TippsSpülen, Reinigen & Equilibrieren

Effektives Spülen einer RP-HPLC-Säule

Der Fall Dass eine HPLC-Säule ab und zu gespült werden muss, ist eine Binsenweisheit. Nur, wie macht man so etwas effektiv – es soll gründlich und es soll auch ökonomisch sein. Wenn Sie im Labor eine entsprechende Spülprozedur haben mit der Sie zufrieden sind, besteht natürlich kein Handlungsbedarf. Und Sie sind wahrscheinlich zufrieden, wenn Sie erstens bei Ihren Läufen keine Geisterpeaks, keinen Memoryeffekt, keine „Buckel“ etc. feststellen und zweitens die ganze „Spülerei“ keine 2-3 Stunden in Anspruch nimmt. Sollte allerdings einer dieser zwei Fakten zutreffen, bestünde womöglich Optimierungspotenzial. Nachfolgend finden Sie einen Vorschlag. Die Lösung 1. Verunreinigungen Vorbemerkung als Erinnerung...
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21. Februar 2010
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseChromatogrammGradientHPLC-TippsIntegration

Integration von Peaks auf einer driftenden Basislinie

Der Fall Bei Gradiententrennungen oder im Falle von Matrix-belasteten Proben müssen oft Peaks, die sich auf einer mehr oder weniger stark driftenden Basislinie oder auf einem flachen „Buckel“ befinden, integriert werden. Die Frage ist nun, wie tut man so etwas am besten? Da die meisten Anwender nicht über Peakhöhen auswerten, wird hier auf diese – oft sinnvolle – Möglichkeit nicht weiter eingegangen. Die Lösung Nachfolgend werden für zwei Fälle Lösungsansätze vorgeschlagen, die sich nach aufwendigen Überprüfungen als das kleinere Übel erwiesen haben (1). 1. Nicht-aufgelöste Peaks auf einer abfallenden Basislinie, s. Abb. 1. (Das Beispiel wurde freundlicherweise von Hans-Joachim Kuss...
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29. Januar 2010
HPLC-Tippspolare KomponentenZ - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Der HPLC-Tipp im Dezember

Liebe Leserinnen, liebe Leser, wir haben es geschafft und einige von uns sind womöglich auch selbst geschafft: Ein nicht ganz gewöhnliches Jahr neigt dem Ende zu. Zeit, sich etwas Zeit zu nehmen und vielleicht das eine oder andere zu reflektieren. Vergessen Sie für einen Moment die rein fachlichen Dinge und begleiten wir gemeinsam den kleinen POL Ari auf einer seiner Abenteuerreisen. Von kalten, dunklen Seen und von knisternden Begegnungen… POL Ari schaute sich um: Es war still und recht kalt in der Tiefe des dunklen Sees. Das bläuliche, gedämpfte Licht verstärkte die unheimliche Stimmung. Dies störte ihn allerdings herzlich wenig,...
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29. November 2009
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsMethodenentwicklung, -Transfer und -OptimierungUHPLC und Miniaturisierung

Wenn „UHPLC“ als UHPLC genutzt werden soll…

Der Fall Seit Einführung der UPLC von Waters im Jahre 2004 haben mehrere Anbieter nachgezogen, in der Zwischenzeit wird eine ganze Reihe von UHPLC-Systemen angeboten. Diese Geräte machen den Großteil der Neukäufe aus. Die Erfahrungen sind durchaus positiv, man sollte sich jedoch einige Sachen bewusst machen. Die Lösung Manchmal werden UHPLC-Geräte lediglich zur Verkürzung der Analysenzeit von alten Methoden benutzt. Beispielsweise wird aus einem alten 20-30 min-Lauf mit 5-10 Peaks mithilfe der UHPLC ein 5-8 min-Lauf. Wenn dies in etwa das avisierte Ziel war und man damit zufrieden ist, ist alles OK, der Methodentransfer HPLC-UHPLC sollte funktionieren und im Alltag...
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29. Oktober 2009
ACNC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseEluentHPLC-TippsLösungsmittelWasser

ACN-Knappheit – wie hatte damals der Markt darauf reagiert?

Der Fall Vor Längerem schockierte eine plötzlich aufgetretene ACN-Knappheit den Markt. Hier aber auch in Broschüren und auf den Webseiten nahezu aller großen Anbieter wurden damals diverse Vorschläge zur (M)Linderung des Problems diskutiert. Die Brisanz des Problems ist heute Geschichte, die hohen Preise dagegen sind geblieben. Ein derartiges Scenario kann sich jedoch wiederholen. Wie auch immer, ist in das Bewusstsein der Anwender durch diese Situation folgendes Ziel wesentlich stärker gerückt: Der Lösungsmittelverbrauch soll möglichst reduziert werden – das gebietet neben ökonomischen Gründen auch unsere Verantwortung gegenüber der Natur – man bräuchte also brauchbare Alternativen zu ACN. Mich hat nun die...
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29. September 2009
A FehlersucheACNChromatogrammEluentHPLC-TippsIntegrationUncategorizedVeränderung der RetentionszeitVeränderung des Chromatogramms

Die „Kleinen“ im Sommer

Verschiebung der Retentionszeit (2) Im diesem Tipp haben wir uns mit der Verschiebung der Retentionszeit beschäftigt, die Ursachen lagen in einer Veränderung der stationären Phase im Sinne der „Chemie“. Hier werden wir uns Änderungen der mobilen Phase widmen. Auch in diesem HPLC-Tipp geht es um ungewollte Veränderungen, also um solche, die nicht vom Anwender bewusst vorgenommen wurden, z. B. Eluenten-Zusammensetzung oder pH-Wert verändert. Nachfolgend werden einige Gründe für eine veränderte Eluenten-Zusammensetzung genannt. Sie resultieren durch kleine, ungeachtete/unbedachte Variationen beim Ansetzen der mobilen Phase oder während der Trennung. Ein Eluent wird z. B. manchmal dadurch hergestellt, dass der Puffer und die...
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29. Juli 2009
A FehlersucheChromatogrammHPLC-TippsUncategorizedVeränderung der RetentionszeitVeränderung des Chromatogramms

Die „kleinen“ im Sommer

Hier geht es um eine unerwartete Verschiebung der Retentionszeit, d.h. um eine, die ohne eine bewusste Veränderung seitens des Anwenders erfolgt ist, also: Es wurde keine längere/kürzere/dünnere Säule eingebaut oder die Flussrate geändert. Grundsätzlich liegt in einem solchen Fall eine Verschiebung der Retentionszeit an einer Änderung der Temperatur, der stationären Phase (d.h. „Chemie“ der Oberfläche) und des Eluenten. Ungewollte Temperaturänderung stellt ein eher seltenes Problem dar, deswegen werden wir uns hier zunächst mit der stationären und dann dort mit der mobilen Phase befassen. Veränderung der stationären Phase Bemerkung: Es geht hier um eine Veränderung im Sinne der „Chemie“, d.h. nicht...
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29. Juni 2009
ApparaturAuflösungBodenzahlC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseChromatogrammHPLC-TippsInjektionsvolumenPeakverbreiterungTotvolumen

„Trennleistung“, „Effizienz“, „Bandenverbreiterung“ das alles bedeutet doch fast das gleiche – oder?

Der Fall Betrachten wir folgende drei Säulen: 250 mm 5 µm, 150 mm 3 µm und 75 mm 1,5 µm. Mit Hilfe der empirischen Formel: Bodenzahl = 3.000 x Länge der Säule in cm durch Teilchengröße in µm stellen wir leicht fest, dass alle drei Säulen – vorausgesetzt sie sind gleich gut gepackt – die gleiche Bodenzahl, nämlich 3.000 x 5 = 15.000 Böden liefern. Sind nun die Säulen wirklich vergleichbar, kann ich also bei gleicher Bodenzahl (15.000 Böden) und völlig identischen chromatographischen und apparativen Bedingungen die gleiche Trennung, sprich die gleiche Auflösung erwarten? Bemerkung: Vorteile der kürzeren Säulen wie...
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29. Mai 2009
AuflösungB OptimierungBodenzahlHPLC-TippsMethodenentwicklung, -Transfer und -OptimierungNachweisgrenzeOptimierungVeränderung der Retentionszeit

Wie kann die Bodenzahl erhöht werden?

Der Fall Halten wir zunächst folgendes fest: Eine Erhöhung der Selektivität stellt mit Abstand die effektivste Maßnahme dar, um die Auflösung zu verbessern. Folglich sollte diesem Schritt als erstem die ganze Aufmerksamkeit zu Beginn einer Methodenoptimierung geschenkt werden. Wenn jedoch eine Verbesserung der Selektivität mit einem vertretbaren Aufwand nicht zu erzielen ist, wäre die Erhöhung der Bodenzahl der zweitbeste Weg. Welche Möglichkeiten gibt es nun, dies zu erreichen und welche Maßnahme „bringt“ wie viel? Die Lösung In Abb. 1 sind die Möglichkeiten zusammengefasst, die zu einer Erhöhung der Bodenzahl führen. Symbol-Erklärung: N: Bodenzahl R: Auflösung („Resolution“) S/N: Peak/Rausch-Verhältnis („Signal to...
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29. April 2009
A FehlersucheEinstellparameterHPLC-TippsIntegrationkleine PeaksMethodentransferNachweisgrenzeVeränderung der Peakfläche

Einfluss von Einstellparametern auf die Trennung

Der Fall Im diesem Tipp ging es um den Einfluss von Einstellparametern auf die Peakform und damit auch auf die Auflösung. So „verschwinden“ schmale, früh eluierende Peaks bei zu groß eingestellten Werten für die Zeitkonstante (z. B. 0,7-1 s) bzw. zu kleinen Datenraten (z. B. 1-2 Hz). Nun mache ich in Seminaren und Workshops die Erfahrung, dass auch erfahrene Anwender die Brisanz der Einstellparameter unterschätzen. Deswegen greife ich hier das Thema erneut auf und gehe kurz auf den Einfluss der Bandbreite (engl. „bandwidth“) bei einem Dioden Array Detektor auf das chromatographische Ergebnis ein. Die Lösung Abb. 1 Zum Einfluss der...
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29. März 2009
ACNC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseEluentHPLC-TippsLösungsmittel

Acetonitril-Knappheit – 1 mm ist viel…

Der Fall Vor längerer Zeit schon kam unerwartet ein großes Problem auf uns zu: ACN-Knappheit. Da das Problem hinreichend bekannt ist, möchte ich nicht auf Details eingehen, vielmehr wollen wir uns über mögliche Auswege unterhalten, sollte das Problem in einer globalisierten Welt wieder auftauchen. Es ist nicht verkehrt, sich um Lösungsmittelverbrauch in der HPLC im allgemeinen und ACN im speziellen Gedanken zu machen. Welche Möglichkeiten gibt es nun, den ACN-Verbrauch zu vermeiden oder wenigstens zu senken? Die Lösung Nachfolgend werden mögliche Lösungsansätze mit kurzer Stellungnahme/Kommentierung vorgestellt: Auf alternative ACN-Distributoren ausweichen Vielleicht lohnt es sich, gezielte Internet-Recherchen zu starten; so war...
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2. Februar 2009
B OptimierungHPLC-TippsInjektionsvolumenLösungsmittelOptimierungPeakverbreiterungProbenlösungsmittelVeränderung des Chromatogramms

In wie weit beeinflusst die Probelösung die Auflösung?

Der Fall Im diesem Tipp haben wir uns über den Einfluss des organischen Lösungsmittels in der Probelösung sowie deren pH-Wert auf die Peakform und somit auch auf die Auflösung unterhalten. Darüber hinaus spielt das Injektionsvolumen und der Verdünnungsgrad der Probelösung eine Rolle. Es dürfte allgemein bekannt sein, dass eine Verringerung des Injektionsvolumens zu einer Verbesserung der Trennung führt, deswegen wird hier nicht weiter darauf eingegangen. Hier möchte ich gerne den Einfluss der Konzentration der Probelösung kurz diskutieren, es geht letzten Endes um die Frage: Was ist besser, eine konzentrierte Probelösung in einem kleinen Injektionsvolumen oder eher ein größeres Volumen einer...
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29. Januar 2009
HPLC-TippsZ - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Der HPLC-Tipp im Dezember

Achte auf deine Gedanken, denn sie werden deine Worte. Achte auf deine Worte, denn sie werden deine Taten. Achte auf deine Taten, denn sie werden dein Charakter. Achte auf deinen Charakter, denn er wird dein Schicksal. Talmud   Liebe Leserinnen, liebe Leser, ich freue mich immer wieder sehr früh im Jahr auf den Dezember-HPLC-Tipp: Wie Sie wissen, versuche ich zum Jahresausklang Ihnen etwas besonderes anzubieten. So auch in diesem Jahr – ich hatte bereits im August etwas vorbereitet gehabt. Dennoch biete ich Ihnen statt dessen mit Erlaubnis des Autors eine Textpassage aus dem Buch von Jürgen Fuchs „Das Märchenbuch für...
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7. Dezember 2008
A FehlersucheApparaturC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseFlussHPLC-TippsPumpeVeränderung der PeakflächeVeränderung der Retentionszeit

Die Retentionszeit bleibt konstant – ist somit auch der Fluss automatisch OK?

Der Fall Sie stellen fest, dass bei Wiederholinjektionen einer Probe die Retentionszeit konstant bleibt. Bedeutet dies, dass alle Faktoren, die die Retentionszeit beeinflussen können, also – neben Temperatur, Eluent und stationärer Phase – auch der Fluss in Ordnung sind? Die Lösung Bei den drei Erstgenannten zweifelsohne, beim Fluss nicht unbedingt. Erläuterung: Bekanntlich unterscheiden wir bei einer Pumpe zwischen der Langzeit- und der Kurzzeitkonstanz. Wenn die Retentionszeit bei Wiederholinjektionen konstant bleibt, ist die Langzeitkonstanz der Pumpe (also die Streuung des Flusses im Langzeitbereich) in der Tat OK. Daneben gibt es aber auch die Kurzzeitkonstanz der Pumpe: Konstanz des Flusses im Kurzzeitbereich,...
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7. November 2008
A FehlersucheB OptimierungHPLC-TippsLösungsmittelpH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels)polare KomponentenProbenlösungsmittelVeränderung des Chromatogramms

Einfluss des Probelösungsmittels auf die Trennung

Der Fall Wir haben uns bereits über den Einfluss der Probelösung auf die Peakform und somit auf die Trennung unterhalten. So führt ein zu starkes Probelösungsmittel (Probe z. B. in mehr MeOH oder ACN im Vergleich zum Eluenten) zum Fronting oder gar zu Doppelpeaks, andererseits führt ein schwaches Probelösungsmittel – mehr Wasser im Vergleich zum Eluenten – zur Aufkonzentrierung am Säulenkopf und somit zu einer Verbesserung der Peakform. Die Folge lautet im zweiten Fall: Verbesserung der Auflösung bzw. Erniedrigung der Nachweisgrenze, vor allem bei früh eluierenden Peaks. In letzter Zeit haben wir uns intensiv mit der Injektion befasst und haben...
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7. Oktober 2008
B OptimierungC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseEinstellparameterHPLC-TippsIntegrationVeränderung des Chromatogramms

Empfehlungen in Geräte-Handbüchern – seien Sie etwas vorsichtig!

Der Fall Handbücher von Gerätehersteller sind meist sehr nützlich – zwar manchmal viel zu umfangreich und von Softwarespezialisten statt von Analytikern verfasst, aber dennoch: Manches wird erst nach deren Lektüre wirklich klar. Trotzdem ist Vorsicht geboten: Einige Empfehlungen sind irreführend oder einfach falsch. Welche Beispiele könnte man diesbezüglich anführen ? Die Lösung Dergleichen gibt es einiges, hier möchte ich beispielhaft auf zwei Empfehlungen bzgl. Einstellparameter eingehen: 1. In manch einem Manual steht, dass ein Peak mit 20-25 Datenpunkten ausreichend darstellbar sei. Dies stimmt jedoch nicht für schnelle Peaks. Bei einer Peakbreite von z. B. 9 s im Falle eines schnell...
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7. September 2008
A FehlersucheHPLC-TippsMethodentransferUncategorized

Die „Kleinen“ im Sommer

Nachfolgend möchte ich gerne diverse Themen ansprechen. Basisliniendrift ACN/TFA (Trifluoressigsäure) ist ein beliebter Gradient in der RP-HPLC. Bei niedrigen Wellenlängen hat man allerdings oft mit einer sehr störenden Drift zu tun und im Falle von kleinen Peaks wird deren Integration dadurch stark erschwert. Abhilfe: Statt der üblichen Konzentration von 0,1% TFA kann man einfach 0,085% TFA verwenden. Vielleicht wird die Selektivität kaum verändert, man stellt jedoch eine wesentlich schwächere Drift fest. Irreversible Sorption an Oberflächen Über dieses leidige Thema haben wir uns des öfteren unterhalten. Dennoch möchte ich es wieder aufgreifen, weil viele Reproduzierbarkeitsprobleme mit der Peakfläche damit zusammenhängen. Und...
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7. August 2008
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseEluentHPLC-TippsLösungsmittelUncategorized

Die „Kleinen“ im Sommer

Eluent im weitesten Sinne  Mikroorganismen In MeOH/H2O/H3PO4-Gemischen können Algen recht schnell wachsen, ist dagegen ACN als organisches Lösungsmittel zugegen, passiert dies eher selten. In H2O/Essigsäure bzw. in Acetatlösungen existiert dieses Problem ebenso, denn für manche Mikroorganismen stellen Acetate, insbesondere Ammoniumacetat,  ein Leckerbissen dar. Wie auch immer, denken Sie daran, eine UV-Lampe verhindert Algenwachstum Folgender Fall: Sie haben festgestellt, dass Sie montags Vormittag häufiger Probleme mit Geisterpeaks haben als sonst die Woche über. Möglicher Grund: Natürlich läuft Ihre Milliporeanlage für das HPLC-Wasser über´s Wochenende. Weil allerdings kaum jemand am Wochenende Wasser entnimmt, kann sein, dass an der Entnahmestelle Mikroorganismen wachsen können...
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7. Juli 2008