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BodenzahlC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseChromatogrammHPLC-Tipps

Wie aussagekräftig sind Bodenzahlen?

Der Fall Die Bodenzahl ist bekanntlich ein Maß für die Effizienz (Packungsqualität) einer Säule. Selbstverständlich indirekt auch für die Güte der verwendeten Apparatur, weil ja letztere durch ihr Totvolumen auch zur Bandenverbreiterung beiträgt. Angaben zu Bodenzahlen findet man nun reichlich in der Literatur und – aus Anwendersicht vielleicht am interessantesten – in den Säulenzertifikaten (Belegchromatogramme), die einer neuen Säule stets beigelegt sind. Kann man nun diese Angaben direkt vergleichen, um zu einer Aussage zu kommen in etwa: „Die Säule vom Hersteller X weist eine höhere Bodenzahl, als die vom Hersteller Y auf, also ist erstere besser gepackt“? Die Lösung Nein,...
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sk
7. September 2006
A FehlersucheHPLC-TippsUncategorized

Die „Kleinen“ im Sommer

Hier etwas „bunte“ Tipps: Wellen in der Basislinie (kein Versatz der Basislinie – das wäre Luft) können durch Flussschwankungen oder durch eine alte UV-Lampe hervorgerufen werden. Differenzierung: Bei der Pumpe sind diese Wellen mehr oder weniger regelmäßig (periodisches Muster), bei der Lampe eher unregelmäßig und hochfrequent Letztens hatte ich einige längere Messungen durchgeführt und da ist mir folgendes passiert: Ich lasse häufig einen Integrator mitlaufen. Obwohl er genügend Papier hatte, kam stets die Meldung „Papier all“. Ich kämpfte ewig und tapfer gegen ihn, aber er hat stets gewonnen: „Papier all“. Die Messungen fanden in der Psychiatrie statt – vielleicht hat...
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sk
7. August 2006
A FehlersucheACNBehältnisseDichtungenHPLC-TippsUncategorizedVeränderung der Peakfläche

Die „Kleinen“ im Sommer

Probleme mit dem Behältnis Probleme mit der Peakfläche  Probleme mit dem Behältnis Proteine – aber auch andere Moleküle – können an Polyethylen-Oberflächen adsorbiert werden, deswegen sollten Polypropylen- oder Glasgefäße verwendet werden. Es sollte jedoch Borosilikatglas möglichst vermieden werden, auch hier ist eine Physisorption durch Adhäsionskräfte denkbar. In jedem Fall empfiehlt sich entweder eine gründliche Behandlung der Glasoberfläche mit HCL/HNO3 und/oder deren Silylierung z. B. mit Trichlormethylsilan. Oder das Beste: Sie kaufen sich gleich inertisierte Glas-Behältnisse In einer Studie wurde das Wachstum von Mikroorganismen in Abhängigkeit vom Aufbewahrungsgefäß untersucht. Mikrobiologische Tests haben gezeigt, dass bereits nach einer Woche 1/4 bis 1/3...
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sk
7. Juli 2006
A FehlersucheHPLC-TippsUncategorized

Die „Kleinen“ im Sommer

Verunreinigungen Temperatur  Verunreinigungen zum Ersten: Können Sie einen hartnäckigen Memory-Effekt aus dem Gerät (Autosampler, Detektorzelle usw.) weder durch Spülen mit heißem Wasser noch durch Spülen mit Acetonitril/Tetrahydrofuran/Isopropanol par toute nicht entfernen, bleibt wirklich nur der alt-bewährte Trick übrig: Passivieren mit 6N HNO3 . Details zur Durchführung, siehe hier. Verunreinigungen zum Zweiten: In einem Labor hatten die Kollegen trotz gründlichem Spülen der Anlage Monate-lang immer mit einem Memory-Effekt des zu analysierenden Wirkstoffs zu tun. Mal war der Peak im Chromatogramm kleiner, mal größer, aber er war stets zugegen – trotz neuer Säule, neuem Eluenten und … neuem Chef. Erst die sehr(!)...
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7. Juni 2006
A FehlersucheApparaturAuto-SamplerC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseDetektorHPLC-TippsProbengeber

Fassen Sie Ihre HPLC-Anlage ruhig an…

Der Fall Häufig haben AnfängerInnen vor dem Gerät einen unnötig hohen Respekt oder dieses ist ihnen sogar suspekt. Es wird bei Bedarf lediglich die Säule vorsichtig ausgetauscht, sonst wird nichts angefasst – man weiß ja nie… Mit „Engelszunge“ gelingt mir vor Ort vielleicht, dass z. B. die Säule andersherum eingebaut wird, um sie schneller von Verunreinigungen frei zu bekommen. Das war´s dann auch. Wenn ich mich mal dem Gerät „verdächtig“ nah komme, blicke ich oft auf äußerst verängstigte Augen. Das muss bei Gott nicht sein! Man kann – ja man soll(!) bei Bedarf doch manche Handgriffe ruhig ins Auge fassen....
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7. Mai 2006
A FehlersucheDoppelpeaksFlussHPLC-TippsVeränderung der Retentionszeit

Fehlersuche: Probleme, Ursache(n), Lösung(en)

Der Fall Im Alltag helfen bei auftretenden Problemen schnelle Lösungen. Das Wälzen von Handbüchern ist in solchen Fällen weniger hilfreich, googeln vielleicht eher. Frau Anja Olschewski, Landesumweltamt Essen, hat sich die Mühe gemacht und manch eine Hilfestellung (auch) aus dem Internet zusammengestellt. Es ist eine praxisbezogene Tabelle für den Alltag entstanden, die mir gut gefallen hat. Sie wird nachfolgend von ihr aus kollegialer „Liebe“ für HPLC-Menschen zur Verfügung gestellt. Die Lösung Das Fazit Für eine Reihe von Symptomen gibt es häufig eindeutige Ursachen. Eine wie hier vorgestellte Tabelle, vielleicht um Ihre Erfahrungen erweitert, am besten direkt am Gerät angebracht, hilft,...
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7. April 2006
A FehlersucheApparaturDetektorEinstellparameterHPLC-TippsPumpeZ - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Kleine Änderungen – große Wirkung

Der Fall In diesem Tipp haben wir uns Spaßes halber folgenden Fall vorgestellt: Sie sollten sich überlegen, welche kleine („böse“) Änderungen methodischer und/oder apparativer Natur Sie bewusst vornehmen könnten, Änderungen, die eine große Auswirkung z. B. im Chromatogramm (Retentionszeit, Peakform, Peakhöhe, Basislinie usw.) oder an der Anzeige, z. B. Druck, haben. Die Frage war anschließend, ob ein mehr oder weniger erfahrener Anwender schnell dahinter kommt, was Sie geändert haben. Findet derjenige es schnell heraus, hätte er diese fiktive Wette gewonnen. Betrachten wir das Ganze seriös und realistisch: Es gibt in der Tat eine ganze Menge Sachen, die wir in der...
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7. März 2006
A FehlersucheChromatogrammDoppelpeaksHPLC-Tipps

Doppelpeaks

Der Fall Während eines Laufs bei einer mehr oder weniger bekannten Applikation stellen Sie auf einmal Doppelpeaks fest. Was könnte die Ursache sein? Die Lösung Um es vorweg klar zu stellen: Hier sind keine zusätzliche Peaks gemeint, deren Ursprung eine zweite, nicht-abgetrennte Komponente, Luft, Memory-Effekt, allerlei Kontaminationen usw. sein können, sondern „richtige“ Doppelpeaks. Die wichtigsten/häufigsten Ursachen zusammen mit einigen Kommentaren sind in Tab. 1 zusammengestellt. Bemerkung zum letzten Hinweis: In einem konkreten Fall wurde erst durch die schleichende Änderung des pH-Wertes im Laufe einer langen Messserie erkannt, dass ein Peak, der am Anfang „fantastisch“ ausgesehen hat, eben nicht homogen war....
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7. Februar 2006
B OptimierungBodenzahlChromatogrammHPLC-TippsInjektionsvolumenTotvolumen

Legale Tricks, um eine geforderte Bodenzahl doch noch zu erreichen

Der Fall Nehmen wir an, dass eine der Forderungen in der Prüfvorschrift einer Routine-Methode lautet: „Bodenzahl für Peak X mindestens 5.000“. Dass ich der Meinung bin, dass eine derartige Forderung unnötig ist, bringt nichts zur Sache, lassen Sie mich dennoch diese These kurz erläutern: Bei einer Trenntechnik wie der HPLC geht es ja um Trennung und das wichtigste – um nicht zu sagen das ausschließliche – Kriterium für eine ausrechende Trennung ist die Auflösung (Auflösung, vereinfacht: Abstand zwischen den Peaks an der Peakbasis). Wenn ich nun die geforderte Auflösung von beispielsweise 1,3 oder 1,5 erreiche, bedeutet dies, dass ich in...
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7. Januar 2006
HPLC-TippsZ - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Eine ungewöhnliche Wette…

Also wissen Sie, liebe Leser, der alte Albert, der hat wahrscheinlich schon ein bisschen Recht mit seiner Relativitätstheorie –  sagen jedenfalls gescheite Menschen, die diese Sachen verstanden haben. Aber irgendwie denke ich, es muss anders herum richtig sein. Jedenfalls kommt es mir so vor, dass der Raum zwar konstant bleibt, aber die Zeit, die wird immer kleiner! Ich werde dem Verdacht nicht los, dass entweder durch G5, oder die Globalisierung, oder die Außerirdischen usw. die Jahre immer kürzer werden. Kaum zu glauben, dass die Monate wie früher in den alten guten Zeiten tatsächlich immer noch um die 30 Tage haben...
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7. Dezember 2005
A FehlersucheHPLC-TippsLösungsmittelpH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels)ProbenlösungsmittelVeränderung der Retentionszeit

Der pH-Wert in Probelösungen bestehend aus Methanol/Wasser

Der Fall Hier haben wir uns über das Driften des pH-Wertes ins Alkalische nach der Zugabe von einem organischen Lösungsmittel in einen sauer/wässrigen Eluenten unterhalten. Eine derartige Verschiebung findet natürlich auch in Probelösungen statt. Diese Verschiebung wird allerdings nicht immer als eine der möglichen Ursachen für Peakformveränderungen, sowie Reproduzierbarkeitsprobleme mit der Retentionszeit und der Peakfläche erkannt. Deswegen wollen wir diese Thematik noch einmal aufgreifen, im hiesigen HPLC-Tipp geht es um die Frage: „Mit welchen pH-Werten bzw. pH-Wert-Verschiebungen in Probelösungen muss ich wann rechnen?“ Die Lösung Halten wir zunächst folgendes fest: Methanol ist ein protisches Lösungsmittel, das sowohl als Protonen-Donator als...
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7. November 2005
A FehlersucheChromatogrammGeisterpeaks & negative PeaksHPLC-TippsPeaks vor - oder nahe - der Totzeit

Einige Ursachen für negative Peaks

Der Fall Negative Peaks stellen eine ärgerliche Sache dar, die bei einigen Applikationen stets zu beklagen ist oder aber sie tauchen immer wieder völlig unberechenbar auf. Was könnte(n) die Ursache(n) sein? Die Lösung Wie leider Gottes in der HPLC üblich, gibt es eine ganze Reihe von möglichen Ursachen. Nachfolgend werden die häufigsten genannt. Brechungsindex- bzw. Leitfähigkeitsdifferenz Die meisten UV-Detektoren sind nicht Brechungsindex-entkoppelt, d.h. sie registrieren eine eventuelle Differenz zwischen dem (konstanten) Brechungsindex des Eluenten und dem Brechungsindex des Eluentensegments, das gerade die Zelle passiert. Das kann eine Luftblase sein, oder irgend welche Schlieren durch eine Druckwelle, die durch das Gerät...
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7. Oktober 2005
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippspH-Wert des EluentenRobustheitUncategorizedVeränderung der Peakfläche

Die „Kleinen“ im Sommer

Kleine Tipps zur Fehlersuche und Robustheit Möchte man starke Basen trennen, so eignen sich bekanntlich Ionenpaarreagenzien (z. B. Heptan- oder Oktansulfonsäure oder bei sehr starken Basen Dodecylsulfonsäure, SDS) als Modifier im Eluenten. Denken Sie vielleicht alternativ an 0,01% Pikrinsäure: Man bekommt hervorragende Peakformen, die Pikrinsäure bleibt an der stationären Phase anders als die Ionenpaarreagenzien nicht „hängen“, wir brauchen keine negative Peaks zu befürchten, usw. Suchen Sie nach einer wirklich guten Methode, um zu prüfen, wie genau Ihr Probengeber arbeitet? Verwenden Sie Brombenzol als Testsubstanz: Legen Sie ein vial mit ca. 500 µl vor, wiegen Sie es ab und injizieren anschließend...
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7. Juli 2005
A FehlersucheChromatogrammHPLC-TippsVeränderung des Chromatogramms

Symptome und Ursachen in der Routine-HPLC

Der Fall Änderungen im Chromatogramm einer Routine-Methode können bestimmten Ursachen zugeschrieben werden. Eine Zuordnung ist natürlich nicht immer einfach bzw. eindeutig. Die bewusste Wahrnehmung der Korrelation jedoch zwischen Symptom und Ursache hilft bei der Eingrenzung von mehreren, möglichen Ursachen. Beschränken wir uns hier auf die häufigsten Fälle, desweiteren setzen wir voraus, dass seitens des(r) Anwenders(in) keine Hardware- oder sonstige Änderung bewusst vorgenommen wurde, z. B. eine längere Säule oder eine längere/dünnere Kapillare eingebaut. Die Lösung In Tab. 1 sind auf der linken Spalte häufige Symptome und auf der rechten Seite mögliche Ursachen aufgeführt. Δ : Änderung F : Fluss tm...
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7. Juni 2005
B OptimierungHPLC-Tippskleine PeaksMethodenentwicklung, -Transfer und -OptimierungUHPLC und Miniaturisierung

Apparative Notwendigkeiten für schnelle, schmale Peaks

Der Fall Miniaturisierung in der HPLC ist seit langem ein zeitloses Thema…  Die Diskussion ist zwar seit Mitte der 1970er Jahre im Gange, doch werden erst in der jüngeren Vergangenheit neben den entsprechenden Geräten auch eine Reihe von Säulen mit den Dimensionen 10-20 mm Länge, 1,0-2,1 mm Innendurchmesser und Sub 2 µm Teilchen in bemerkenswerter Vielfalt angeboten. Bei solchen Säulen haben wir natürlich mit sehr kurzen Analysezeiten und schmalen Peaks zu tun. Bemerkung: Kapillarsäulen, „Pillar Array Columns“, „Column On a Chip“ sind in der Routine (noch) eher selten, daher werde ich hier nicht darauf eingehen. Was sind nun die (apparativen)...
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7. Mai 2005
ApparaturC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseFlussGradientHPLC-TippsSpülen, Reinigen & Equilibrieren

Wie lange sollte die übliche Equilibrierzeit bei einer RP-Säule sein?

Der Fall Eine RP-Säule ist häufig zu equilibrieren: Beim „Einfahren“, wenn sie neu ist, beim Umspülen, wenn ein neuer Eluent eingesetzt wird, nach einem Gradientenlauf vor der nächsten Injektion, wenn sie nach getaner Arbeit gelagert wird usw. Wie lange sollte dieser Vorgang nun dauern? Die Lösung Halten wir zunächst folgendes fest: Die Frage sollte weniger lauten „wie lange?“ sondern viel mehr „wie viel Volumen sollte ich über die Säule schicken?“ Beim Einfahren, Um- bzw. Spülen gilt als Faustregel: Ca. 10-15 Säulenvolumina pro Spülschritt bei einfachen Eluenten bzw. üblichen Verunreinigungen und 30-50 Säulenvolumina pro Spülschritt im Falle von komplexeren Eluenten bzw....
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7. April 2005
A FehlersucheChromatogrammGeisterpeaks & negative PeaksHPLC-Tipps

Ungewöhnliche Ursachen für Geisterpeaks/Spikes

Der Fall Geisterpeaks bzw. Spikes sind eine häufige, ärgerliche Sache. Wir haben uns des Öfteren über dieses Problem unterhalten. Nun, man sollte in einem solchen Fall nicht nur an bekannte Quellen sondern – vor allem im Falle von unregelmäßig auftretenden Geisterpeaks – auch an ungewöhnliche Quellen denken, die mit der eigentlichen HPLC-Arbeit wenig zu tun haben. Was wären das? Die Lösung Nachfolgend werden kurz einige Ursachen für Geisterpeaks/Spikes genannt, an die man eher selten denken würde. Diese Beispiele basieren auf reale Fälle. Periodisch erscheinende Spikes, die Klima-Anlage und sonstige Geräte in der unmittelbaren Umgebung der HPLC-Anlage können als Ursache ausgeschlossen...
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7. März 2005
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsRobustheit

Ursachen für mangelnde Robustheit

Der Fall Sie übernehmen eine validierte Methode, die allerdings im Laufe der Zeit sich nicht als sonderlich robust erweist. Wieso gibt es immer wieder Probleme mit der Robustheit von validierten bzw. offiziellen Methoden, z. B. Arzneibuchmethoden? Die Lösung Das grundsätzliche Problem – eher ein Management- denn ein analytisches Problem – besteht darin, dass die Zeit, die für die Validierung einer Methode zur Verfügung steht, meist nicht ausreicht, um die Eignung besagter Methode unter Routinebedingungen zu überprüfen. Eine „Validierung“ unter optimalen Bedingungen und zusätzlich unter Zeitdruck liefert unweigerlich „Sonntagswerte“, die mit dem realen Alltag denkbar wenig zu tun haben. Das Validierungselement...
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7. Februar 2005
HPLC-TippsMethodenentwicklung, -Transfer und -OptimierungZ - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Ein HPLC-Tag im Dezember 2014

Liebe Leserinnen, liebe Leser, diesen HPLC-Tipp habe ich im Dezember 2004 geschrieben und einen (nicht ganz ernst gemeinten und bewusst übertriebenen) Blick auf die HPLC des Jahres 2014 skizziert. Es ist zwar heute alles „Schnee von gestern“ aber als „historischen“ Text lasse ich auch diesen Tipp in unserer Datenbank drin… „Es kommt nicht darauf an, die Zukunft vorherzusagen, sondern auf die Zukunft vorbereitet zu sein“ Perikles Getreu unserer Tradition werden wir in der Dezember-Ausgabe uns nicht mit Fachlichem im strengeren Sinne beschäftigen, sondern einem Thema in einer etwas lockeren Art nähern und somit das Jahr ein wenig ruhig ausklingen lassen....
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7. Dezember 2004
A FehlersucheEluentGradientHPLC-TippsLösungsmittelpH-Wert des Eluentenpolare KomponentenVeränderung der RetentionszeitVeränderung des Chromatogramms

Von 100% wässriger zu 100% organischer Phase – mögliche Probleme bei Gradientenläufen

Der Fall Manche AnwenderInnen arbeiten im Gradienten-Modus mit vorgemischten Eluenten, manche legen jeweils 100% A (z. B. Puffer) und 100% B (z. B. ACN) vor und lassen das Gerät die gewünschte Mischung herstellen. Mit nicht-vorgemischten Eluenten kann es zu Problemen kommen, welche wären das und warum? Die Lösung Wenn 100% Puffer und 100% ACN zusammengeführt werden, besteht die Gefahr, dass in dünnen Kapillaren Salze ausfallen (z. B. ab ca. 85% ACN und mehr als 30-30 Mmol Puffer) Wird ein Gradient von 100% A auf 100% B gefahren, herrscht nicht nur der beabsichtigte Lösungsmittelgradient, sondern gleichzeitig ein pH-Wert- und ein Salzgradient....
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7. November 2004