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B OptimierungGradientHPLC-TippsLebensdauer der SäuleOptimierungVeränderung der RetentionszeitVeränderung des Chromatogramms

Peaks kommen zu spät – was tun?

Der Fall Sie haben eine Trennung mit einer guten Auflösung erzielt. Die nächste Frage könnte (sollte!) wie folgt lauten: „Wie kann ich am unproblematischsten die Analysenzeit verkürzen?“ Die Lösung Ganz einfach: Fluss erhöhen. Es ist mir bewusst, dass vielen LeserInnen diese Antwort recht banal erscheint. Im Grunde genommen ist sie es auch. Dennoch macht es Sinn darauf hinzuweisen, denn es existieren für meine Begriffe weltweit einfach viel zu viele Prüfvorschriften mit „Fluss: 1 ml/min“. Eine Flusserhöhung führt stets zu Zeitersparnis oder beim Gradienten sogar zur Verbesserung der Auflösung (siehe weiter unten), die Nachteile, die man sich einhandelt, sind gering –...
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sk
8. Oktober 2000
B OptimierungEinstellparameterHPLC-TippsIntegrationWellenlänge

Die richtige Wellenlänge – „es ist eine alte Geschicht´, doch bleibt sie immer neu“

Der Fall Ich habe wirklich lange mit mir selber gerungen, ob ich diese Trivialität als „HPLC-Tipp“ schreiben soll. Nachdem ich mich jedoch vor kurzem einen halben Tag „dumm und dämlich“ nach verlorenen Peaks gesucht habe und ich sämtliche mir bekannte griechische, deutsche und saarländische Schimpfworte losgeworden bin, wage ich es doch. Meine Lehre daraus ist: Fangen Sie bitte an, eine Trennung zu optimieren oder nach einem Fehler zu suchen erst dann, wenn Sie 100 % sicher sind, dass die eingestellte Wellenlänge optimal beziehungsweise richtig ist. Übertreibe ich vielleicht ein bisschen? Die Lösung Ich denke nein, es sei denn, Sie sind...
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sk
15. August 2000
B OptimierungEinstellparameterHPLC-TippsIntegration

Einstellparameter einer HPLC-Apparatur

Der Fall Die Einstellparameter eines analytischen Instruments sind wichtig, das ist sicherlich geläufig. Dennoch mache ich die Erfahrung, dass jene leider nicht immer den Applikations-relevanten optimalen Wert haben. Das ist schade, denn häufig führen solche legale „Manipulationen“ zu ausreichender Auflösung ohne z. B. Säule oder Eluent wechseln zu müssen. Um welche Einstellungen geht es konkret? Die Lösung Ich denke, wir können auf das Eingeben von selbstverständlichen Parametern  wie z.B. Fluss, Temperatur oder Injektionsvolumen verzichten. Nachfolgend eine kurze Übersicht über einige Parameter der „zweiten“ Reihe. Zu jedem Punkt der Tabelle gibt es schöne Beispiele, greifen wir hier die Zeitkonstante („time constant“,...
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sk
14. Juli 2000
A FehlersucheHPLC-TippspH-Wert des Eluentenpolare KomponentenVeränderung der Retentionszeit

Verschiebung des pH-Wertes im Eluenten – Gründe und Ausmaß

Der Fall Je mehr ich mich mit der Rolle des pH-Wertes befasse, um so „erschreckender“ wird für mich die Erkenntnis, wie schwerwiegend und diffizil sein Einfluss auf die Trennung von sauren und alkalischen Komponenten in der RP-HPLC ist… Hier wollen wir einen einzigen Aspekt herauspicken und zwar die Gründe für seine ungewollte Verschiebung. Also: Wann müssen wir mit einer pH-Wert-Verschiebung rechnen? Die Lösung Dazu gleich die Ergebnisse einiger Experimente, die ich in letzter Zeit durchgeführt habe: Was sind die Konsequenzen? Eine unkontrollierte pH-Wert-Verschiebung kann die Robustheit der Methode beeinträchtigen, d. h. es können sowohl die Retentionszeit als auch die Selektivität...
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sk
7. Juni 2000
A FehlersucheHPLC-Tipps

Peakdeformation und Retentionszeitverschiebung aufgrund eines ungeeigneten Probelösungsmittels

Der Fall Sie arbeiten mit einer einfachen, robusten Methode. Auch Ihre Säule ist recht neu. Dennoch eluieren alle oder ein Teil Ihrer Peaks mit einem Fronting und/oder die Retentionszeiten sind nicht konstant. Was könnte der Grund sein? Die Lösung Ein Fronting (das Gegenteil von Tailing, manchmal als „Fronttailing“ bezeichnet) ist fast immer als sicherer Hinweis anzusehen, dass Probelösungsmittel und Eluent nicht identisch sind. Oder noch konkreter, das Probelösungsmittel ist stärker als der Eluent. Sie arbeiten beispielsweise mit MeOH/H2O oder ACN/H2O beziehungsweise Puffer als Eluent und die Probe ist in reinem Methanol oder Acetonitril gelöst. Ergebnis: Fronting oder sogar Doppelpeaks, evtl....
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sk
10. Mai 2000
B OptimierungChromatogrammHPLC-TippsOptimierungSäulenauswahlStationäre Phase

Nicht-endcappede Phasen – „ad acta“ legen?

Der Fall In den letzten Jahren wurde eine Vielzahl neuartiger C18-Phasen eingeführt. Da wären beispielhaft zu nennen: Chemisch geschützte („embedded“ phases), hydrophil endcappte sowie Mixed Mode Phasen und was die Matrix betrifft: Hybrid-, Core Shell-, monolithische Phasen. Diese Materialien weisen vielfach Vorteile auf. Heißt es nun, dass bei der Entwicklung einer neuen Methode der Einsatz einer solchen modernen Phase die richtige Wahl ist? Sollte man also nicht-endcappede Phasen als alte Technologie „ad acta“ legen? Die Lösung Nein. Für die Trennung von Substanzen mit ähnlicher Hydrophobie, aber mit Unterschieden in der Anordnung von Substituenten am Molekül oder von Doppelbindungen in einer...
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5. April 2000
A FehlersucheGradientHPLC-TippspH-Wert des EluentenVeränderung der RetentionszeitVeränderung des Chromatogramms

Warum verschiebt sich der pH-Wert trotz richtigem Puffer und ausreichender Pufferkapazität?

Der Fall Sie arbeiten mit einem RP-System und folgendem Eluenten: MeOH (oder Acetonitril)/ Kaliumdihydrogen-Phosphatpuffer, pH = 7,5, 45/55 (v/v) und trennen basische Substanzen. Die Trennung ist gut, viel zu gut. Also erhöhen sie – um Zeit zu gewinnen – den Methanolanteil auf 80 % oder Sie fahren einen 40 → 80 % MeOH-Gradienten bei sonst gleichen Bedingungen … und Sie verstehen die Welt nicht mehr: Die Basen kommen nicht einfach früher wie es sich gehört. Nein, alle oder ein Teil davon macht riesige Retentionszeit-Sprünge nach hinten und/oder die Selektivität ändert sich und/oder die Säule hält nicht mehr so lange und so...
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7. März 2000
B OptimierungHPLC-TippsOptimierungpH-Wert des Eluentenpolare Komponenten

Wie trenne ich Säuren mittels RP C18?

Der Fall Nehmen wir an, Sie möchten organische Verbindungen mit saurem Charakter trennen. Die Rede ist nicht von Aminosäuren oder organischen/anorganischen Säuren. Für diese Substanzklassen existieren sehr gute Standardapplikationen. Bei Ersteren erfolgt die Trennung durch Vor- beziehungsweise Nachsäulederivatisierung und Gradientelution. Letztere werden an starken/schwachen Ionenaustauschern getrennt. Welche RP-Systeme könnten nun in Frage kommen? Die Lösung Man nehme wie folgt: Die Säule Nicht endcappede, „klassische“ Säulen, weil diese im Sauren, siehe weiter unten, stabiler als endcappede sind oder einige moderne, speziell für den Einsatz im Sauren entwickelte Säulen, es sei hier je ein Vertreter genannt: LiChrospher, Zorbax SB. Der Eluent Es...
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5. Februar 2000
B OptimierungEluentGradientHPLC-TippsOptimierungpH-Wert des EluentenSäulenauswahlStationäre Phase

Entwicklung einer RP-Trennung – die „2 –Tage-Methode“: Säulen- und Eluentenauswahl

These: Es ist realistisch, eine Methode innerhalb von zwei Arbeitstagen zu ca. 80% zu entwickeln. Betrachten wir folgenden fiktiven Fall (Siehe für eine  kürzer-gefasste Version dieses Konzepts diesen HPLC-Tipp): Der Fall Ihr Chef kommt Dienstag Morgen recht konsterniert ins Labor, überreicht Ihnen eine ganz, ganz wichtige Probe direkt aus der Synthese und fleht Sie an, eine Trennung bis morgen Abend irgendwie hinzukriegen. Er fliegt am Donnerstag früh in die Staaten und bräuchte dringend die Information über die Anzahl der Probenbestandteile, es geht also um qualitative Analyse. Eigentlich ist Ihr Chef ein netter Mensch und das ist nicht seine Art, also...
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8. Januar 2000
B OptimierungC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsMethodenentwicklung, -Transfer und -OptimierungOptimierungPeakverbreiterungTotvolumenUHPLC und MiniaturisierungVeränderung der RetentionszeitVeränderung des Chromatogramms

Miniaturisierung ja – aber was ist in der Routine wirklich machbar und sinnvoll?

Der Fall Miniaturisierung ist aus wirtschaftlichen und analytischen Gründen häufig ein vernünftiger Ansatz. Was ist nun mit einem „normalen“ Gerät machbar und wann lohnt es sich? Die Lösung Vorbemerkung Für folgende Fälle kann ich die Skepsis mancher Kollegen gegenüber Miniaturisierung nachvollziehen und teilweise sogar teilen: Stark regulierte Umgebung, matrixbelastete Proben und/oder große Anzahl an Komponenten, keine HPLC-Spezialisten in Routine-/Betriebslabors, knappe Zeit, um auftretenden Fehlern nachzugehen, usw.. Das bedeutet keinesfalls, dass in solchen Fällen Miniaturisierung nicht sinnvoll ist, es heißt nur, dass vor einer „Ja/Nein“-Entscheidung eine nüchterne Analyse mit objektiven und belegbaren Vor-/Nachteilen unabdingbar ist, z. B: Was gewinne ich an...
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14. Dezember 1999
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsRobustheitVerweilvolumen

These: Der häufigste Grund für schlechte Reproduzierbarkeit ist eine mangelnde Methodenrobustheit!

Der Fall Ein häufiges Problem in der Routine-HPLC ist die mangelnde Reproduzierbarkeit von Peakfläche/Peakhöhe und Retentionszeit. Wenn die Funktionstüchtigkeit der Apparatur durch Kalibrierung/Qualifizierung bewiesen wurde, liegt der Grund fast immer in einer mangelnden Methodenrobustheit. Das heisst mit anderen Worten, dass bei der Methodenvalidierung das Validierungselement „Robustheit“ nicht gebührend überprüft wurde. Ein Grossteil von späterem Ärger und zusätzlichen Kosten durch Reklamationen, Wiederholmessungen oder gar Vernichtung von einwandfreien Partien liegt in einer nicht-robusten Analytik. Das zeigen leider viele Beispiele. An was sollte nun der Methodenentwickler bzw. Validierer einer HPLC-Methode bezüglich Robustheit denken? Die Lösung Das Thema „Robustheit von HPLC-Methoden“ wird ausführlich in...
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10. November 1999
ApparaturAuflösungBodenzahlC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseChromatogrammHPLC-TippsMethodentransferPeakverbreiterungTotvolumenVeränderung des ChromatogrammsVerweilvolumen

Was kann sich ändern, wenn man die HPLC-Anlage wechselt?

Der Fall Ihre Pumpe mag plötzlich partout nicht mehr. Streicheln, Schimpfen, Dichtungen auswechseln, das alles hilft diesmal nicht. Da die (ebenfalls isokratische) HPLC-Anlage dort drüben in der Ecke nicht in Betrieb ist und Sie Ihre Serie fertig bekommen müssen, nehmen Sie Ihre Säule, Ihren Eluenten und Ihre Proben mit und versuchen Ihr Glück an dieser zweiten Anlage. Was kann sich im Vergleich zu Ihrer Anlage ändern und was müsste (theoretisch…) gleich bleiben? Die Lösung Wir gehen davon aus, dass erstens die zweite Anlage vor dem Verlassen ordnungsgemäß gespült worden ist, zweitens sie keine technischen Mängel aufweist/qualifiziert ist und dass Sie...
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10. Oktober 1999
A FehlersucheAuto-SamplerGeisterpeaks & negative PeaksHPLC-TippsProbengeber

Zusätzliche Peaks bei Trennungen in der Spurenanalytik

Der Fall Annahme: Sie arbeiten im Spurenbereich und jeder, auch winzigste Peak, ist für Sie von Bedeutung. Lassen Sie uns zwei typische Fälle betrachten: Sie arbeiten mit einer bekannten Probe und finden bei der zweiten Injektion ein, zwei zusätzliche kleine Peaks, die beim Vergleichschromatogramm fehlen. Ab der dritten, vierten Injektion tauchen sie nicht mehr auf. Sie arbeiten mit einer neuen Probe. Die erste Injektion ist in Ordnung, die zweite bis fünfte jedoch droht Ihre gute Freitags-Laune zu verderben, denn auf einmal erscheinen neue Peaks im Chromatogramm. Nachdem Sie nun nachmittags eine Wiederholmessung gewagt haben, sind Sie nach einem Blick auf...
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9. September 1999
ApparaturC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsVeränderung der RetentionszeitVeränderung des Chromatogramms

Sind 40 °C gleich „40 °C“?

Der Fall Eine Retentionszeitverschiebung hat mehrere Gründe, darüber haben wir uns häufiger unterhalten. Einer der Gründe ist eine Differenz bei der aktuellen Trenntemperatur. So weit so gut. Sie übernehmen nun eine Methode mit der Angabe „40 °C“ und stellen dementsprechend Ihren Säulenofen auf 40 °C ein. Stellen Sie nun fest, dass die Retentionszeit sich etwas verschoben hat, so würden Sie kaum eine Temperaturdifferenz als Ursache annehmen, die Temperatur-Anzeige ist ja in Ordnung und das Gerät ist qualifiziert! Tun Sie mir und Ihnen den Gefallen und seien Sie hier etwas vorsichtig. Jetzt fragen Sie sich, „ist denn 40 °C nicht gleich...
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10. August 1999
A FehlersucheHPLC-TippspH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels)Veränderung der PeakflächeVeränderung der RetentionszeitVeränderung des Chromatogramms

Systematische Vorgehensweise beim Auftreten von Problemen

Der Fall Sie arbeiten im Routinelabor und stehen immer wieder vor Problemen. Natürlich wäre optimal, wenn Sie sofort die Lösung hätten. Sofort-Lösungen zu erhalten ist jedoch äußerst selten im Leben und konkrete Tipps bekommen Sie (vielleicht) beim Studium von Fachbüchern, von erfahrenen KollegInnen oder im Rahmen von Weiterbildungsveranstaltungen. Nachfolgend schlage ich Ihnen ein Strategie-Schema vor, wie man vorgehen kann. Auch wenn es auf den ersten Blick theoretisch und recht allgemein erscheinen mag, hilft eine solche oder ähnliche systematische Vorgehensweise sehr. Diagnose von und Umgang mit HPLC-Fehlern Problem wiederholbar? Wann tritt das Problem auf? Nur freitags, nur bei mir usw? Symptome...
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9. Mai 1999
AuflösungBodenzahlC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseChromatogrammHPLC-Tipps

Was ist der Unterschied zwischen Totzeit und Totvolumen, Selektivität und Auflösung?

Der Fall Ich mache immer wieder die Erfahrung, dass eine Reihe von Begriffen im HPLC-Alltag nicht einheitlich benutzt werden. Das führt unweigerlich zu Missverständnissen. Daher mein Anliegen hier, dass wir wenigstens ein Paar dieser Begriffe „sauber“ definieren. Die Lösung Totzeit, to oder tm (Lösungsmittelpeak, Front, Durchbruchszeit, Mobilzeit) ist die Aufenthaltszeit aller Komponenten im Eluenten. Sie ist für alle Komponenten gleich. Anders formuliert: Das ist die Zeit für eine inerte Komponente; inerte Komponente ist eine Komponente, die in alle Poren des Füllmaterials hinein diffundieren kann, aber keine Wechselwirkung mit der stationären Phase eingeht. Eine solche Komponente kann folglich sich nur im...
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14. April 1999
AuflösungC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsLebensdauer der SäuleVeränderung der RetentionszeitVeränderung des Chromatogramms

Je älter desto besser: Beim Portwein sicher, beim Rotwein vielleicht – und bei einer C18-Säule?

Der Fall Die Erfahrung lehrt, dass mit der Zeit die Qualität einer HPLC-Säule abnimmt, die Peaks werden breiter. Ist auch der umgekehrte Fall denkbar? Die Lösung Ja. Halten wir nun folgendes fest: Die Aussage, „die C18-Säule ist schlechter geworden“ kann zweierlei bedeuten. Zum einen kann es sich um eine mechanische Beanspruchung der Packung handeln, deren Ausmaß im wesentlichen von dem Fluss, dem Druck, der Temperatur, der Anzahl der Injektionen und dem Betriebsmodus (isokratischer-/Gradientenbetrieb) abhängt. Lässt nun die Qualität der Packung nach, so manifestiert sich dies mit Peakverbreiterung und/oder Tailling, evtl. sogar mit Doppelpeaks – die Retentionszeit bleibt dabei konstant. Zum...
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4. März 1999
A FehlersucheChromatogrammHPLC-TippsVeränderung der RetentionszeitVeränderung des Chromatogramms

Was ändert sich am Chromatogramm, wenn das Totvolumen einer isokratischen Anlage größer ist als bei einer anderen?

Der Fall Eine isokratische Methode soll auf ein anderes Gerät übertragen werden; die aktuelle Apparatur weist ein um 100 μl größeres Totvolumen auf, als die Apparatur, an der die Methode entwickelt wurde. Muss man mit merklichen Unterschieden im Chromatogramm rechnen und wenn ja mit welchen? Die Lösung Ein Totvolumen führt bekanntlich zu Peakverbreiterung, die Auflösung wird schlechter evtl. sogar unzureichend bei früh eluierenden, kritischen Peaks. Was kann noch passieren? Die Retentionsfaktoren (k-Werte, relative Retention) nehmen auch ab. Erläuterung: Es gilt: k Retentionsfaktor (früher: Kapazitätsfaktor, k‘) tR Retentionszeit einer Komponente tm Totzeit (Retentionszeit einer inerten Komponente) Durch eine Vergrößerung des Totvolumens...
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10. Januar 1999
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsSäuleStationäre Phase

3 μm Material – reif für die Routine?

Der Fall In HPLC-Kursen werde ich mit Fragen konfrontiert, die sicherlich auch andere Anwender beschäftigen. Eine lautete vor kurzem: “ In letzter Zeit tauchen immer häufiger in Prospekten Werbetexte mit Vorteilen der 3 gegenüber den 5 μm-Materialien auf. Sind sie für die Routine tatsächlich reif?“ Die Lösung Ja, wenn bestimmte Voraussetzungen erfüllt sind. Vorbemerkung: Die Rede ist von 3 μm, doch beträgt bei den meisten Materialien der mittlere Partikeldurchmesser tatsächlich 3,5 μm. Der Grund: Das 3,5 μm Material „passt“ gerade nicht durch die verbreiteten und allgemein verwendeten Fritten und Filter. Eine weitere Herabsetzung des Partikeldurchmessers würde eine Änderung von Gewohnheiten...
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14. Oktober 1998
A FehlersucheChromatogrammHPLC-TippsVeränderung der RetentionszeitVeränderung des Chromatogramms

Die Peaks kommen mit der neuen, „identischen“ Säule später – warum?

Der Fall Sie haben eine neue Säule bestellt, die soeben angekommen ist. Obwohl Sie die gleiche Säule (stationäre Phase und Säulendimensionen) bestellt haben, und Sie dem Lieferanten auch treu geblieben sind, kommen die Peaks trotz konstant gehaltener chromatographischer Bedingungen später. Warum? Die Lösung Nehmen wir an, dass die chromatographischen Bedingungen (Temperatur, Eluent incl. pH-Wert, Pufferstärke usw. ) und auch die Probenvorbereitung tatsächlich konstant geblieben sind. Überprüfen Sie nun, ob die Totzeit (Frontpeak, Durchbruch) auch später eluiert. Ist das der Fall, dann ist wahrscheinlich der Fluss nicht mehr konstant: Schauen Sie nach Luft in der Pumpe bzw. nach einer Leckage. Stellen...
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14. August 1998