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A FehlersucheACNGradientHPLC-TippsLösungsmittel

Die „Kleinen“ im Sommer

Probleme, die direkt oder indirekt mit dem Lösungsmittel Acetonitril zu tun haben Fall 1 In einem kleinen Labor, das vom Platz her gar nicht dafür ausgelegt ist, befinden sich 6 HPLC-Geräte. Die KollegInnen dort haben immer wieder Probleme mit Retentionszeitverschiebungen und Reproduzierbarkeitsprobleme bezüglich Peakfläche. Der Grund: Die Klimaanlage schafft es einfach nicht. Im kleinen Raum ist es wegen der Wärmeentwicklung durch die Geräte recht warm. Ergebnis: Unreproduzierbare Herstellung des Eluenten, Verdampfen von Acetonitril, das als Probelösungsmittel verwendet wird und dadurch Aufkonzentrierung der Probelösung. Eine Lösung des Problems ist kurzfristig leider nicht in Sicht. Fall 2 Zwei Labors sollten eine Applikation...
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7. Juni 2008
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsMethodenentwicklung, -Transfer und -OptimierungMethodentransferUHPLC und MiniaturisierungVeränderung der PeakflächeVeränderung der RetentionszeitVeränderung des Chromatogramms

Unterschiede von HPLC- und UPLC/UHPLC-Trennungen

Der Fall Seit Anfang der 2000er (Waters 2004) Jahren werden UHPLC-Geräte eingesetzt. Man könnte nun vereinfacht annehmen, es handele sich dabei um „normale“ HPLC-Geräte, die lediglich so konzipiert sind, dass sie eben hohe Drücke ermöglichen. Das Ergebnis lautet: Merkliche Reduktion der Analysenzeit und des Lösungsmittelverbrauchs, sowie – wegen der kleinen verwendeten Teilchen und der damit verbundenen hohen Bodenzahlen – Verbesserung der Auflösung. Zweifelsohne sind dies aus Anwendersicht die wichtigsten Unterschiede/Vorteile gegenüber klassischen HPLC-Trennungen. Beim Methodentransfer jedoch von HPLC- auf UHPLC-Trennungen sollte man auch an manch eine Besonderheit der UHPLC denken. Damit meine ich nicht bekannte Tatsachen wie peinliche Vermeidung von...
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7. Mai 2008
A FehlersucheAuflösungBodenzahlChromatogrammHPLC-TippsPeakverbreiterungpolare KomponentenVeränderung der RetentionszeitVeränderung des Chromatogramms

Nimm Dir die Zeit und lasse Chromatogramme „sprechen“…

Der Fall Die Chromatogramme „erzählen“ viel – man sollte sich nur die Zeit nehmen, sie etwas bewusst anzuschauen. Das sei nachfolgend anhand der Chromatogramme der Abbildung 1 demonstriert. Dieses Beispiel stammt von der Arbeitsgruppe Prof. Engelhardt, Saarbrücken. Das obere Chromatogramm wurde mit einer neuen Säule aufgenommen, das zweite nachdem die Säule ein Jahr lang in Methanol/Wasser gelagert wurde. Was fällt auf und wie können wir die Unterschiede erklären? Abb. 1 Die zwei Chromatogramme wurden mit einem Abstand von ca. ein Jahr bei identischen chromatographischen Bedingungen aufgenommen, die Säule war in dieser Zeit in Methanol/Wasser gelagert Die Lösung Es fallen direkt...
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7. April 2008
A FehlersucheHPLC-TippsIntegrationMethodenentwicklung, -Transfer und -OptimierungMethodentransferVariationskoeffizient (Vk)

Unterschiedliche Peakflächen beim Methodentransfer

Der Fall In diesem Peak haben wir uns mit physikalisch/chemischen Ursachen beschäftigt, die beim Methodentransfer zu unterschiedlichen Flächen (und somit zu unterschiedlichen Gehalten) führen  – trotz technisch einwandfreier Hardware. Hier geht es um Probleme bei der Anwendung der Methode, einmal durch unterschiedliche Zahlenwerte innerhalb der Spezifikationsanforderungen und einmal durch Unterschiede bei den Einstellparametern, sowohl was die Datenaufnahme als auch die Integration betrifft. 1. Spezifikationsanforderungen Betrachten wir als Beispiel folgende Anforderungen in einer Prüfvorschrift: „ pH-Wert des Eluenten 4,5 +/- 0,1 pH-Einheiten, Tailingfaktor des Hauptpeaks kleiner/gleich 1,3, Auflösung R zwischen Hauptpeak und Verunreinigung größer/gleich 1,5“. Im Extremfall – aber immer noch innerhalb...
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7. März 2008
A FehlersucheAuto-SamplerEinstellparameterHPLC-TippsIntegrationkleine PeaksMethodentransferNachweisgrenzeProbengeberVeränderung der Peakfläche

Unterschiedliche Peakflächen beim Methodentransfer

Der Fall Unterschiedliche Peakflächen – und somit unterschiedliche Gehalte – sind leider Gottes nichts Ungewöhnliches beim Methodentransfer. Wir unterstellen, dass durch Gerätequalifizierung in den betreffenden Labors technische Fehler, die zur Änderung der Peakfläche führen könnten, ausgeschlossen werden können: Fluss, Wellenlänge, Injektionsvolumen sind in Ordnung. Der Einfachheit halber gehen wir weiterhin von baugleicher HPLC-Hardware aus. Nun, es gibt für das hier besprochene Problem eine Reihe von Ursachen, an die man zunächst nicht ohne weiteres denken würde. Hier werden wir uns mit eher physikalisch/chemischen Ursachen beschäftigen, in diesem Tipp geht es dann um Probleme bei der Anwendung der Methode (Auslegung von Spezifikationen...
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7. Februar 2008
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseChromatogrammHPLC-TippsIntegrationVeränderung der Peakfläche

Auswertung über die Peakfläche oder über die Peakhöhe?

Der Fall In nahezu jedem Regelwerk wird „expressis verbis“ vermerkt, dass die Auswertung sowohl über die Peakfläche als auch über die Peakhöhe erfolgen kann. Dennoch hat sich in der Praxis bis auf wenigen Ausnahmen die Auswertung über die Peakfläche etabliert. Ich bin Realist genug zu wissen, dass sich diesbezüglich kaum etwas grundsätzliches ändern wird. Es lohnt sich allerdings schon, sich einigen Fakten bewusst zu machen. Die Lösung Zur Vorbereitung für ein Buch über Integration und Auswertung (1) haben wir uns intensiv mit dem Thema „Integration“ auseinandergesetzt. Hans-Joachim Kuss und Mike Hillebrand haben mehrere Software auf ihre Fähigkeit zur „richtigen“ Integration...
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7. Januar 2008
HPLC-TippsLebensdauer der SäuleVorsäuleZ - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Die Säule meldet sich zu Wort…

Liebe HPLC-Anwenderinnen, liebe HPLC-Anwender, es weihnachtet…Lassen Sie uns auf eine etwas unkonventionelle Art und Weise ein paar Vorsichtsmaßnahmen wiederholen, die zur merklichen Verlängerung der Lebensdauer einer RP-Säule führen – die Säule meldet sich heute selbst zu Wort und bekundet auf ihre typisch unbekümmerte Art ihre Wünsche. Hallo, ich bin deine Säule! Danke, dass du mich gekauft hast; wir werden viele glückliche Wochen und Monate miteinander verbringen – aber nur, wenn du gaaanz lieb zu mir bist! Denk bitte daran, ich mag keinen Druck – übrigens genauso wie du… – aber ein Sensibelchen bin ich auch wiederum nicht: Ca. 350-380 bar...
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7. Dezember 2007
B OptimierungChromatogrammHPLC-TippsOptimierungPeaks vor - oder nahe - der Totzeitpolare KomponentenVeränderung der RetentionszeitVeränderung des ChromatogrammsVorsäule

Eine/mehrere polare Komponente(n) eluiert(en) direkt an der Totzeit – was tun?

Der Fall Nehmen wir an, Sie können Ihre viele, mehr oder weniger apolare Komponenten recht gut trennen. Nur eine oder zwei Komponente(n) bereitet(n) Ihnen Kopfzerbrechen: Jene polare eluiert(en) direkt beim Totzeitpeak bzw. an der Flanke des an der Totzeit eluierenden polaren „Drecks“. Wie auch immer, gestaltet sich deren Integration als wahres Abenteuer. Wenn Sie nun großartig Gradient, Säule usw. ändern würden, mit dem Ziel diese(n) polare(n) Peak(s) nach hinten zu verschieben, könnte es sein, dass womöglich die Trennung restlicher Peaks sich ändert/verschlechtert und dazu haben Sie logischerweise keine Lust. Was tun? Die Lösung Bauen Sie vor Ihre C18-Säule eine kurze...
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7. November 2007
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsSäule

Wie aussagekräftig ist die Angabe „X % C“ bei einer RP-Phase?

Der Fall Man findet bei den Angaben zu den physikalisch-chemischen Eigenschaften von RP-stationären Phasen in Datenblättern von Herstellern u. a. gelegentlich auch die Angabe „% C“. Man geht nun davon aus, dass je höher diese Zahl ist (also der Kohlenstoffgehalt der stationären Phase), um so stärker die Belegung und damit auch der hydrophobe Charakter der entsprechenden Phase ist. Stimmt das? Die Lösung Nicht unbedingt! Man muss auch die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Kieselgels in Betracht ziehen – hier zunächst einmal konkret dessen Packungsdichte, siehe dazu Tabelle 1, in der zwei stationäre Phasen von Waters verglichen werden. Bondapak hat zwar mit 9,80%...
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7. Oktober 2007
A FehlersucheACNChromatogrammGradientHPLC-TippsLösungsmittelVeränderung des ChromatogrammsVorsäuleWellenlänge

Ursachen für Drift

Der Fall Drift ist je nachdem zwischen lediglich störend und äußerst ärgerlich. Wann ist nun mit Drift zu rechnen? Die Lösung Nachfolgend werden die häufigsten Ursachen genannt: Isokratische Trennungen Die Temperatur ist nicht konstant. Das Problem ist allerdings nur dann wirklich groß, wenn eine merkliche Temperaturdifferenz zwischen Eluent und Säulenraum herrscht Bei einigen Detektoren wie elektrochemischem Detektor oder Brechungsindexdetektor dauert es recht lange, bis die Basislinie stabil ist Die Säule ist (noch) nicht im Gleichgewicht. Bei komplexen Eluenten (z. B. Puffer mit Ionenpaarreagenzien) oder beim Umspülen auf einen „ganz“ anderen Eluenten kann die Gleichgewichtseinstellung recht lang dauern Langsame Elution von...
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7. September 2007
A FehlersucheApparaturDetektorHPLC-Tippskleine PeaksNachweisgrenzeUncategorizedVeränderung der Peakfläche

Die „Kleinen“ im Sommer

Besteht Bedarf, das Rauschen zu minimieren (Hinweis von Hans-Joachim Kuss, München)? Man braucht dazu zunächst nur ausrechnen, wie hoch das Rauschen ist. Je nach Anforderung kann anschließend entschieden werden, ob aktuell Handlungsbedarf besteht oder eben nicht. Ein Beispiel dazu: Nehmen wir an, Sie betreiben Nebenkomponenten-Analytik, d.h. Sie haben beispielsweise einen Hauptpeak mit einem Ausschlag von 1V und mehrere kleine Peaks mit einem Reporting Level von 0,05%, was häufig das zweifache der Bestimmungsgrenze beträgt. 0,05% von 1 V – der Ausschlag des Hauptpeaks – sind 500 µV. Als Bestimmungsgrenze wird oft ein S/N-Verhältnis („Signal/Rauschen-Verhältnis“) von 10:1 definiert, im vorliegenden Beispiel sollte also...
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7. August 2007
B OptimierungFlussGradientHPLC-TippsNachweisgrenzeOptimierungUncategorized

Die „Kleinen“ im Sommer

Alternativen zu Phosphor- und Trifluoressigsäure Bekanntlich werden für den stark sauren Bereich (pH-Wert um 2-2,5) gerne H3PO4 oder TFA verwendet. Der pH-Wert wird häufig nicht eingestellt, auch auf die Verwendung von Puffern wird verzichtet: Eine mögliche kleine Verschiebung des pH-Wertes ist in diesem recht sauren Bereich nicht tragisch, eine merkliche Verschiebung der Retentionszeit wird selten beobachtet. Nun zeigt sich immer wieder, dass nicht nur der pH-Wert – sicherlich der wichtigste Faktor! – sondern auch die verwendete Säure die Selektivität beeinflussen kann. Man sollte bei Optimierungsversuchen im Sauren beispielsweise neben den üblich verwendeten Säuren Phosphor-, Trifluoressig-, Essig-, und Ameisensäure auch an...
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7. Juli 2007
A FehlersucheApparaturHPLC-TippsSpülen, Reinigen & EquilibrierenUncategorized

Die „Kleinen“ im Sommer

Kontaminierte Fritten – was bewirken sie? „Hohen Druck!“ kommt aus Ihrem Munde. Natürlich richtig, aber nicht nur. Was noch? Doppelpeaks, wobei der zweite „Peak“ bzw. Aufsetzer sich oft unterhalb der Peakmitte ansetzt, Ergebnis: oft ein tailender „Fuß“ An der verschmutzten Frittenoberfläche kann durch Adhäsionskräfte ein Teil der(s) Analyte(n) irreversibel adsorbiert werden, Ergebnis: kleinere Peakfläche Auch Luftblasen können dort leicht „hängen“ bleiben, Ergebnis: häufige(r) Luftprobleme Durch diese Blockade/Verstopfung erhöht sich lokal der Druck, damit der an der Pumpe eingestellte Fluss tatsächlich weiterhin fließen kann. Dadurch ergibt sich eine etwas höhere Temperatur, Ergebnis: geringe Abnahme der Retentionszeit Spülen mit Methanol Eine RP-Phase...
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7. Juni 2007
B OptimierungGradientHPLC-TippsMethodenentwicklung, -Transfer und -OptimierungOptimierungSäulenauswahlStationäre Phase

Schnelle Methodenentwicklung in der RP-HPLC

Der Fall Sie müssen eine Methode schnell entwickeln und Sie haben wenig Zeit. Selbstverständlich verfügen Sie über eine moderne Gradientenanlage und über ein ansehnliches Säulen-Portfolio. Was wäre nun eine sinnvolle, ökonomische Vorgehensweise, um die Methode wenigstens grob entwickeln zu können? Die Lösung Hardware-Voraussetzung: Sollten Sie über eine Niederdruck-Gradientenanlage mit PDA verfügen, benötigen Sie lediglich ein 6-Säulenschaltventil, imfalle eines Hochdruck-Gradienten zusätzlich ein Eluentenschaltventil. Das Konzept Bekanntlich hängt die Selektivität von der stationären Phase, von dem Eluenten (inkl. Gradient) und von der Temperatur ab, wobei zunächst die zwei Erstgenannten in Frage kommen. Stationäre Phase bedeutet „Chemie“ der Oberfläche (also, polarer/hydrophober Charakter der...
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7. Mai 2007
ACNC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsLebensdauer der SäuleLösungsmittelOptimierungpH-Wert des EluentenRobustheit

RP-HPLC bei extremen pH-Werten

Der Fall Nehmen wir an, die beste Selektivität erzielen Sie bei einem pH-Wert von ca. 1,5-2 bzw. 9-10. Ihre Säule ist in diesem Fall in der Regel nicht sonderlich begeistert: Im Sauren besteht die Gefahr der Abspaltung der funktionellen Gruppe(n) durch Hydrolyse („Bluten“ der Säule) – jene Gefahr ist um so größer je kürzer/polarer die funktionelle(n) Gruppe(n) ist/sind. Im Alkalischen kann das Kieselgel sich auflösen. Was tun nun, um die Lebensdauer der Säule zu verlängern? Die Lösung Nachfolgend stichwortartig einige Empfehlungen für beide Fälle: 1. Arbeiten im Sauren Säule: Verwenden Sie möglichst Zorbax SB oder eine Hybrid-Säule (siehe weiter unten)...
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7. April 2007
ApparaturC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseDetektorHPLC-Tipps

Vor- und Nachteile des Detektors CAD Corona

Der Fall Seit Längerem gibt es bereits den Detektor CAD Corona (Corona Aerosol Detektor) auf dem Markt und es existieren schon fundierte Erfahrungen aus seinem Einsatz. Es soll hier nicht auf seine Funktionsweise und seine Besonderheiten eingegangen werden, jene sind in dem Info-Material der Anbieter gut und übersichtlich beschrieben. Nachfolgend sollen vielmehr die Erfahrungen aus Anwendersicht kurz zusammengefasst werden. Die Chromatogramme und die vorgestellten Testergebnisse hat Dirk Mautner, Bayer Bergkamen, freundlicherweise zur Verfügung gestellt. Die Lösung Folgende Anwendungsgebiete wären aus Sicht des Test-Labors in Bergkamen zu erwähnen: Routine-Analytik (Gehalts- und Reinheitsbestimmung von Wirk- und Rohstoffen sowie Zwischenprodukten) auch mittels 100%...
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7. März 2007
B OptimierungHPLC-TippsMethodenentwicklung, -Transfer und -OptimierungSäulenauswahlStationäre Phase

Sind hydrophobe oder polare Wechselwirkungen für meine Trennung notwendig?

Der Fall Bekanntlich können in der HPLC, je nach Analyt und chromatographische Bedingungen, hydrophobe Wechselwirkungen dominieren oder aber es liegt ein Mischmechanismus vor. Letzteres bedeutet in aller Regel, es sind zusätzliche polare oder gar ionische Wechselwirkungen wirksam. Sterische Aspekte, die auch für kleine Moleküle eine Rolle spielen können, lassen wir hier außer acht. Nun stellt sich die Frage erstens, wann herrschen vorwiegend eher hydrophobe oder eher polare Wechselwirkungen und zweitens, welche sollte ich wann, wie begünstigen? Die Lösung Hier angesprochenes Thema ist ein sehr Komplexes und es bedarf eines nicht unbeträchtlichen Umfangs, wollte man jenes genauer behandeln. Dennoch sind aus...
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7. Januar 2007
A FehlersucheApparaturGeisterpeaks & negative PeaksHPLC-TippsSpülen, Reinigen & Equilibrieren

Wie gründlich spült eigentlich unsere Spülmaschine – oder: Wieso erscheint stets der Peak unserer Hauptkomponente im Chromatogramm, obwohl wir nichts injizieren?

Der Fall Bekanntlich gibt es Substanzen, die äußerst hartnäckig an allerlei Oberflächen „kleben“ bleiben. Man hofft nun, dass die Oberfläche der verwendeten Glasgefäße wenigstens im Labor-Spülautomaten von einem derart unerwünschten „Besucher“ befreit wird. Klappt es aber wirklich? Die Lösung Bevor Sie in einem solchen Fall die sechste neue Säule einbauen, die Anlage zum zehnten Mal gründlichst spülen und die vierte Spritze am Autosampler auswechseln lassen, sollten Sie vielleicht Ihre Spülmaschine unter die Lupe nehmen und deren Reinigungskraft überprüfen. Selbstverständlich gibt es bei den professionellen Spülmaschinen empfohlene Programme abhängig von der Art der Kontamination und es sind des weiteren sehr gute...
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7. November 2006
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsLösungsmittelWasser

Wie kann die Qualität von HPLC-Wasser überprüft werden und wie macht sie sich in der HPLC bemerkbar?

Der Fall Üblicherweise wird in der HPLC entweder vor Ort aufbereitetes Wasser oder gekauftes „HPLC-“ oder gar „Spektroskopie-Wasser“ verwendet. Solche Wässer weisen eine Leitfähigkeit um die 18 ΩM/cm (ca. 0,05 µSiemens/cm) und einen TOC-Gehalt von ca. 5-10 ppb, oft sogar < 5 ppb auf. Im Zuge von Sparmaßnahmen oder aus organisatorischen Gründen wird immer wieder die Notwendigkeit für die Verwendung von „HPLC-Qualität“-Wasser in Frage gestellt. Ich werde immer wieder gefragt, ob denn vielleicht auch doppel-destilliertes oder einfach entionisiertes oder sonstiges „sauberes“ Wasser verwendet werden kann und ob ein solches die HPLC-Analytik tatsächlich merklich beeinträchtigt. Statt unnötige, zeit- und nervenaufreibende „Glaubens“-Diskussionen...
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7. Oktober 2006
BodenzahlC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseChromatogrammHPLC-Tipps

Wie aussagekräftig sind Bodenzahlen?

Der Fall Die Bodenzahl ist bekanntlich ein Maß für die Effizienz (Packungsqualität) einer Säule. Selbstverständlich indirekt auch für die Güte der verwendeten Apparatur, weil ja letztere durch ihr Totvolumen auch zur Bandenverbreiterung beiträgt. Angaben zu Bodenzahlen findet man nun reichlich in der Literatur und – aus Anwendersicht vielleicht am interessantesten – in den Säulenzertifikaten (Belegchromatogramme), die einer neuen Säule stets beigelegt sind. Kann man nun diese Angaben direkt vergleichen, um zu einer Aussage zu kommen in etwa: „Die Säule vom Hersteller X weist eine höhere Bodenzahl, als die vom Hersteller Y auf, also ist erstere besser gepackt“? Die Lösung Nein,...
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7. September 2006