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A Fehlersuche

Metallionen in der HPLC: „Schlimm“? Und wenn ja, wie schlimm?

Von A Fehlersuche, ACN, Apparatur, Bodenzahl, Peakverbreiterung, polare Komponenten, Veränderung des Chromatogramms

Der Einfluss von Metallionen in der HPLC ist schon seit Längerem bekannt; sprechen wir eher von einem zwar vorhandenen, jedoch bis dato bei vielen Anwender:innen weniger sich stark im Focus befindenden Problem. In den letzten Jahren erlebt dieses Thema allerdings aufgrund der zunehmenden Wichtigkeit von Biomolekülen eine gewisse Renaissance. Um welche Metallionen handelt es sich? Wo kommen sie her und was bewirken sie? Sind sie vermeidbar? Und: Können sie entfernt werden? Doch bevor wir uns dem Thema widmen, zunächst ein kleiner semantischer Exkurs: Konfusion von Begrifflichkeiten Begriffe im hiesigen Zusammenhang werden nicht von allen Beteiligten einheitlich verwendet. Dadurch entsteht eine gewisse Konfusion. Nachfolgend eine kurze Einordnung, wobei diese weder den Anspruch auf Vollständigkeit erhebt, noch kann ich erwarten, dass alle mit dieser 100 % d’accord gehen. Bioinert; geringe Wechselwirkungen mit Hardware-Komponenten, geringes Risiko für carryover; ältester Begriff, bereits 1933 verwendet: Aluminium-Oberfläche als Alternative zu Eisen. Im Umfeld der HPLC sind die verwendeten Materialien hier Titan, Keramik, PEEK Biokompatibel; keine Korrosionsgefahr trotz Chlorid-Ionen im Eluenten; oft synonym bzw. gleich zu setzen mit Bio-LC und Stainless steel-free; verwendete Materialien: Titan und spezielle Legierungen, z. B. MP35N Metall-frei; verwendete Materialien: PEEK, Saphir Weitere anzutreffende Attribute sind: „Inert“, „truly bioinert“ (PEEK), schließlich „fully biocampatible“….

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9. Oktober 2024

Die kleinen HPLC-Tipps im Sommer: Die 80 % Regel, Vorteile Methanol, Probelösung und Eluent

Von A Fehlersuche, B Optimierung, Doppelpeaks, Eluent, Geisterpeaks & negative Peaks, Injektionsvolumen, kleine Peaks, Lebensdauer der Säule, Lösungsmittel, Peaks vor - oder nahe - der Totzeit, Peakverbreiterung, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), polare Komponenten, Probenlösungsmittel, Robustheit

Im – jedenfalls kalendarischen …– Sommer wollen wir uns mit kleinen, knackigen Tipps beschäftigen. Heuer geht es um „die 80 %-Regel“, „Vorteile von Methanol“ und „Mach´ Probelösung und Eluent möglichst ähnlich“. „80%-Regel“ Bei einer Routine-Methode steht i.d.R. Robustheit an erster Stelle, das heißt beispielsweise: Ich erwarte reproduzierbare Ergebnisse und die Säule soll möglichst lange halten. Es hat sich gezeigt, dass ein „Puffer“, also ein Abstand, von ca. 20 % von einem Grenzwert Sicherheit liefert. Nachfolgend einige Beispiele: Einige GPC/SEC-Säulen sind laut Datenblatt bis 100 bar stabil; das Nicht-Überschreiten von 80 bar im Dauerbetrieb beschert eine lange Lebensdauer Manch ‘ein Säulenofen ist von 5 – 80 °C spezifiziert; an beiden Grenzen – also ca. 6 °C sowie ca. 70 °C – ist eine richtige und präzise Temperatur-Einstellung nicht immer gewährleistet. Messungen in diesen Bereichen sind oft nicht reproduzierbar Bei einer Reihe von Säulen wird als pH-Wert-Verträglichkeit der Bereich 2 – 8 angegeben; im Dauerbetrieb würde ich allerdings bei derart spezifizierten stationären Phasen nicht unter ca. pH von 2,4 und nicht über ca. pH 6,5 gehen: Im Sauren können kleine funktionelle Gruppen hydrolysiert werden („Bluten“ der Säule) und ab ca. pH 7,0 kann sich das Kieselgel auflösen. Denke in diesem Zusammenhang auch…

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2. Juli 2024

Eine passende Frage zu diesem Befund …

Von A Fehlersuche, Allgemein, B Optimierung, Eluent, Optimierung, pH-Wert des Eluenten

Liebe Leserinnen, liebe Leser, weiter unten finden Sie den jeweils ersten Teil der halben Sätze aus dem Dezember-Tipp, so dass nun die Befunde komplett sind: Ich weiß, dass … … sich der Fluss geändert hat (Leck, Luft in der Pumpe)… weil die Peakfläche, aber kaum die Peakhöhe sich geändert hat … das Probelösungsmittel organischer ist als der Eluent/der Anfangsgradient… weil die frühen Peaks mit einem starken Fronting eluieren … der pH-Wert des Eluenten sich geändert hat oder – seltener – funktionelle Gruppen auf der stationären Phase hydrolysiert worden und dadurch nun mehr Silanolgruppen vorhanden sind … weil nur einige Peaks tailen und auch später eluieren – restliche Peaks sind OK … dass ich eine recht hydrophobe, endcappte, „klassische“ C18 stationäre Phase habe… weil eine derartige RP-Phase sehr ähnliche Komponenten (z. B. Isomere) nicht trennen kann … dass ich in der Probe entweder sehr große Moleküle oder sehr kleine, ionisch vorliegende Substanzen habe… weil solche Komponenten vor der Totzeit eluieren (Peaks vom letzten Lauf, Kontaminationen im Eluenten, Luft usw. können ausgeschlossen werden) … dass das Totvolumen der Apparatur zu groß im Vergleich zu dem Säulenvolumen ist…weil dies die einzige Ursache sein kann, dass bei neutralen Komponenten die Peaksymmetrie mit zunehmender Retention…

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29. Januar 2024

Wie voll ist Ihr Lösungsmittelreservoir?

Von A Fehlersuche, Behältnisse, Eluent, Geisterpeaks & negative Peaks, Lösungsmittel

Der Fall Eine Methode läuft an zwei identischen HPLC-Anlagen. Eine der zwei Anlagen erzeugt problematische Chromatogramme, z. B. Drift der Basislinie, „Buckel“ oder Geisterpeaks. Woran kann es liegen? Die Lösung Bemerkung: Die hier besprochenen Probleme machen sich insbesondere bei niedrigen Wellenlängen und bei hochauflösenden Massenspektrometern bemerkbar. Eine mögliche Erklärung wäre folgende: An der Anlage, die keine Probleme bereitet, wird Lösungsmittel aufgefüllt, sobald das Reservoir ca. zur Hälfte geleert ist. An der „problematischen“ Anlage wird gewartet bis das Lösungsmittelreservoir fast leer ist, um es wieder aufzufüllen, Ergebnis: Das letztgenannte Handling kann zu unterschiedlicher Konzentration an Störsubstanzen führen. Es ergeben sich womöglich folgende Probleme: Acetonitril-Reservoir Aus Acetonitril kann mit der Zeit Aceton entstehen – und Aceton ist UV-aktiv. Bei geringer Acetonitril-Menge ist die Konzentration an Aceton im Raum über der Acetonitril-Oberfläche hoch, Ergebnis: Leichte Drift, die immer stärker wird Unter Lichteinwirkung können in Acetonitril Polymere entstehen. Bei geringer Acetonitril-Menge im Lösungsmittelreservoir ist deren Konzentration hoch, die Konsequenz lautet: „Buckelige“ Basislinie. Ihre Konzentration bei einem halbvollen Lösungsmittelreservoir dagegen ist gering, das Problem ist nicht existent oder marginal Ähnlich verhält es sich bei geringer Acetonitril-Menge und vorhandenen polaren Verunreinigungen dort wie Nitrile (insbesondere Imine), Acrylnitril, Ammoniak, Essigsäure. In diesem Fall tauchen Geisterpeaks auf. In…

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11. November 2023

Mangelnde Reproduzierbarkeit der Peakfläche bei niedrigen Konzentrationen

Von A Fehlersuche, Injektionsvolumen, kleine Peaks, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), Probengeber, Variationskoeffizient (Vk), Veränderung der Peakfläche

Der Fall Die Injektionsreproduzierbarkeit bei kleinen Injektionsvolumina um die 1-2 µl (oder noch kleiner) stellt bei modernen Geräten heute zunächst keine besondere apparative Herausforderung dar. Falls dennoch in einem aktuellen Fall die Injektionsreproduzierbarkeit zu wünschen übriglässt: Wie sollte verfahren werden? Die Lösung Vorbemerkung: Es versteht sich von selbst, dass für die nachfolgend beschriebene Tests reale Proben injiziert werden sollten; Injektionen von Standardlösungen zeitigen lediglich die Reproduzierbarkeit des Autosamplers für betreffendes Injektionsvolumen. Nicht jedoch, ob „hier und jetzt“ diese Methode an diesem Gerät gemäß den Anforderungen funktioniert. Injektionen von Standardlösungen sind nur dann statthaft, wenn im Rahmen der Validierung belegt worden ist, dass die Probematrix das Ergebnis nicht (signifikant) beeinflusst. Als erstes würde ich das Injektionsvolumen wie in der Methode angegeben sowie das 2-, 3-, 4-fache davon injizieren. Wird die Peakfläche um das 2-, 3-, 4-fache erhöht? Wenn ja wissen Sie, dass in diesem niedrigen Konzentrationsbereich die Linearität gegeben ist. Als nächstes käme ein weiterer, etwas aufwendiger Test, die Notwendigkeit kann nur individuell bejaht werden: Jedes der vier Injektionsvolumina wird 5-mal injiziert und der Variationskoeffizient ermittelt. Der jeweils sich ergebende Variationskoeffizient zeigt Ihnen „schwarz auf weiß“, welche Präzision für welches Injektionsvolumen bei dieser Probe und diesen chromatographischen Bedingungen zu erwarten ist….

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2. September 2023

Wenn die Probleme aus dem vial kommen …

Von A Fehlersuche, Chromatogramm, Geisterpeaks & negative Peaks, Injektionsvolumen, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Sie konnten für bestimmte Probleme (Geisterpeaks, Tailing etc.) das/die vial(s) inkl. Inhaltes als Ursache identifizieren. Und dies obwohl an der Methode eigentlich „nichts“ geändert wurde. An was sollten Sie – auch – denken? Die Lösung Probleme können zunächst durch die Injektion selbst hervorgerufen sein. So kann beispielsweise die Injektionsnadel durch ein Septumpartikelchen oder Salzkriställchen teilweise verstopft sein; oder die Nadelspitze ist aufgrund eines harten (dunkelroten) Septums minimal verbogen; oder sind die Purgeflüssigkeit und/oder die Lösung im Waschvial schlicht alt; oder schließlich verhindert Luft in der Spritze/Injektionsnadel das Ansaugen des eingestellten Injektionsvolumens. Hier wollen wir uns jedoch nur auf das/die vial(s) bzw. sein Inhalt als Fehlerquelle konzentrieren. Nachfolgend sind einige Ursachen aufgeführt, die zu einem veränderten Chromatogramm führen können: Veränderung der Peakfläche bzw. Peakform, zusätzliche Peaks, Retentionszeitverschiebungen etc. Beispiele für Veränderungen der Probelösung Der pH-Wert Ihrer wässrigen Probelösung hat sich durch Silanolgruppen an der Oberfläche des vials geändert, diese Änderung kann innerhalb einer Stunde über eine pH-Wert-Einheit ausmachen. Es kann sein, dass bei einer langen Sequenz sich eine größere – da zeitabhängige – pH-Wert-Veränderung bei den letzten vials stärker bemerkbar macht; oder Sie haben eine neue Charge von vials eingesetzt deren Oberfläche acidere Silanolgruppen aufweist; oder die Probe bleibt…

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5. April 2023

Woher kommt das – weitere Symptome

Von A Fehlersuche, Allgemein, Fluss, Injektionsvolumen, Peakverbreiterung, pH-Wert des Eluenten, Totvolumen

Liebe Leser:innen, zunächst wünsche ich Ihnen ein gesundes, zufriedenes und erfolgreiches Jahr 2023. Im letzten HPLC-Tipp des Jahres 2022 hatte ich Ihnen die Kurztabelle „Symptome-Ursachen“ in der Routine-HPLC vorgestellt. In der zusätzlichen Spalte nun „Welches Symptom noch?“ finden Sie weitere Informationen, die man/frau dem Chromatogramm bzw. den Anzeigen am Gerät entnehmen kann. Diese helfen, die jeweilige Ursache(n) noch genauer zu spezifizieren bzw. noch mehr einzugrenzen.   Änderung (Symptom) Ursache(n) Welches Symptom noch? Kommentar ∆ A + ∆ H 1. ∆ Injektionsvolumen 2. Irreversible Adsorption (Physisorption, Memory-Effekt) 3. ∆ Detektor 4. Instabile Probe 5. ∆ pH-Wert 6. ∆ Probekonzentration                 5. ∆ Peakform 1. Neben Luft und verstopfte Nadel durch “Krümmelchen”, auch unpassende Ansaug- und/oder Injektionsgeschwindigkeit 2. … z. B. an einer Stahloberfläche (Stahlkapillare. Metallsiebchen) 3. Schwache Lampe, Belag in der Zelle 5. Eine ungewollte Änderung des pH-Wertes kann die UV-Absorption beeinflussen 6. Organisches Lösemittel kann bei ungekühltem Autosampler aus dem vial entweichen (anreichern der Probe) ∆ H + ∆ tR, A = konstant 1. Eluent 2. ∆ stationäre Phase 3. ∆ Temperatur 1. ∆ P     3. ∆ P Stets: t0 = konstant, bei isokratischen Trennungen in der Regel auch ∆ Peakform…

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4. Januar 2023

Woher kommt das?

Von A Fehlersuche, Bodenzahl, Detektor, Fluss, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Peakverbreiterung, pH-Wert des Eluenten, Pumpe, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Typischen Symptomen können bestimmten Ursachen zugeordnet werden; oder aber die Zahl der infrage kommenden Ursachen kann durch Beurteilung der Symptome („Welche Veränderung kann dieses Symptom bedingen und welche definitiv nicht?“) wenigstens eingegrenzt werden. Nachfolgend werden beispielhaft sieben häufige „Symptome-Ursachen“ in der Routine-HPLC vorgestellt. Bei Bedarf erfolgt auch ein Kommentar. Für die vorgestellten Fälle gelten folgende Annahmen: Keine bewusste Änderung seitens der Anwender:innen, z. B. es wurde keine längere Säule eingebaut Es handelt sich vorwiegend um RP-Trennungen mit einem konzentrationsempfindlichen Detektor wie beispielsweise UVVis, Diodenarray, Fluoreszenz- oder Brechungsindexdetektor Weiter unten sind die häufigsten Ursachen genannt Symbole: ∆: Änderung H: Peakhöhe A:…

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2. Dezember 2022

Probleme erst gegen Ende der Sequenz – mögliche Ursachen

Von A Fehlersuche, HPLC-Tipps, Peakverbreiterung, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), Veränderung der Peakfläche, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Zu Beginn einer längeren Sequenz läuft alles bestens. Gegen Sequenz-Ende jedoch tauchen verstärkt Probleme auf, z. B. Geisterpeaks, Veränderung der Peakform und/oder der Peakfläche und nicht zuletzt Verschiebung der Retentionszeit. Welche Ursachen kommen in Frage? Die Lösung Es handelt sich hierbei wohl um Ursachen, die zeitabhängig sind. Nachfolgend eine Auswahl von Symptomen und möglichen Ursachen: Temperatur zum Ersten: Druck-, evtl. auch Peakfläche-Schwankungen Es finden manchmal aufgrund einer niedrigen Temperatur im Probengeber Nachfällungen statt, die erst später einsetzen und zu folgenden Problemen führen können: Verstopfung der Injektionsnadel, Niederschlag am Siebchen direkt am Säulenkopf usw. Vorgehen, um ein kommendes Problem…

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30. September 2022

Gründe für eine Verschiebung des pH-Wertes

Von A Fehlersuche, HPLC-Tipps, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), pH-Wert des Eluenten

Der Fall Eine unbeabsichtigte Verschiebung des pH-Wertes kann bei polaren Komponenten viel bewirken. Und das Risiko einer Verschiebung besteht dann, wenn der Mess-pH-Wert nahe dem pKS– bzw. pKB-Wert der betreffenden sauren bzw. basischen Komponente befindet. Es gibt kaum eine chromatographisch relevante Größe, die sich dabei nicht ändern kann: Retentionszeit, Peakform, Peakfläche, Nachweisgrenze, usw. Wir haben uns an dieser Stelle oft über die ein oder andere mögliche Ursache für eine Verschiebung des pH-Wertes unterhalten. Welche sind nun die wichtigsten? Die Lösung Nachfolgend stichwortartig die häufigsten Ursachen nach abnehmender Häufigkeit bzw. Relevanz Nach der Zugabe des organischen Lösungsmittels ändert sich der pH-Wert…

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9. September 2022