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Trends in der HPLC

By Allgemein, Detektor, Eluent, LC-MS-Kopplung, Optimierung

Trends in der HPLC Stavros Kromidas Vom 18.-22. Juni 2023 fand in Düsseldorf die HPLC2023 („International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques”), die wichtigste und größte Tagung auf dem Gebiet der HPLC, statt. Nachfolgend erfolgt ein kurzer Bericht über Trends und Highlights. Vorab jedoch ein Punkt, den ich mir selbst immer wieder bewusst machen muss: Auf solchen Tagungen werden naturgemäß zum großen Teil Ergebnisse und Projekte aus der Forschung vorgestellt. Dieses Bild der HPLC entspricht selbstverständlich nicht der Ist-Situation in „real-life“ Labors. Ob und wann besprochene Techniken das „normale“ HPLC-Labor auf breiter Basis erreichen, ist ungewiss. Highlight: Mehrdimensionale Trennungen Kaum ein Vortrag, ein Tutorial oder ein Poster in dem es nicht um „Multi“ ging: Im einfachsten Fall um Multidetektion, multimodale MS, 3-4 D-Chromatographie usw., also kurzum: Mehrdimensionale Kopplungstechniken. Begründung: Die Herausforderung in aktuell wichtigen Gebieten wie „omics“ (Metabolomics, Lipidomics, Proteomics, Metallomics), Forensik, Umweltanalytik, Spezialpolymeren, personalisierte Medizin etc. lautet: Erfassung von Metaboliten, Verunreinigungen, Zersetzungsprodukten, das sind beispielsweise vielfach Isobare/Isomere – und: Neben der „Trennung“ geht es um möglichst genaue Strukturinformationen, im optimalen Fall um evidenzbasierte Identifizierung. Und dies noch in einer unwahrscheinlich großen und unbekannten Zahl zudem in äußerst geringen Konzentrationen. Schließlich heißt das Ziel: Maximale Information…

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Wenn die Probleme aus dem vial kommen …

By A Fehlersuche, Chromatogramm, Geisterpeaks & negative Peaks, Injektionsvolumen, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Sie konnten für bestimmte Probleme (Geisterpeaks, Tailing etc.) das/die vial(s) inkl. Inhaltes als Ursache identifizieren. Und dies obwohl an der Methode eigentlich „nichts“ geändert wurde. An was sollten Sie – auch – denken? Die Lösung Probleme können zunächst durch die Injektion selbst hervorgerufen sein. So kann beispielsweise die Injektionsnadel durch ein Septumpartikelchen oder Salzkriställchen teilweise verstopft sein; oder die Nadelspitze ist aufgrund eines harten (dunkelroten) Septums minimal verbogen; oder sind die Purgeflüssigkeit und/oder die Lösung im Waschvial schlicht alt; oder schließlich verhindert Luft in der Spritze/Injektionsnadel das Ansaugen des eingestellten Injektionsvolumens. Hier wollen wir uns jedoch nur auf das/die vial(s) bzw. sein Inhalt als Fehlerquelle konzentrieren. Nachfolgend sind einige Ursachen aufgeführt, die zu einem veränderten Chromatogramm führen können: Veränderung der Peakfläche bzw. Peakform, zusätzliche Peaks, Retentionszeitverschiebungen etc. Beispiele für Veränderungen der Probelösung Der pH-Wert Ihrer wässrigen Probelösung hat sich durch Silanolgruppen an der Oberfläche des vials geändert, diese Änderung kann innerhalb einer Stunde über eine pH-Wert-Einheit ausmachen. Es kann sein, dass bei einer langen Sequenz sich eine größere – da zeitabhängige – pH-Wert-Veränderung bei den letzten vials stärker bemerkbar macht; oder Sie haben eine neue Charge von vials eingesetzt deren Oberfläche acidere Silanolgruppen aufweist; oder die Probe bleibt…

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Wann ist eine „gute“ Peakform besonders wichtig?

By Allgemein

Der Fall Vereinfacht gesagt, ist die Trennleistung – Effizienz, „Performance“, als Bodenzahl wiedergegeben – ein Maß für die Peakform. Eine große Bodenzahl bedeutet scharfe, symmetrische Peaks, eine geringe Bodenzahl dagegen breite, evtl. tailende Peaks. Warum ist die Peakform bei der Trennung großer Moleküle, z. B. Biomoleküle, besonders wichtig oder kritisch? Die Lösung Zunächst gilt es drei Punkte festzuhalten: In der Chromatographie ist die Auflösung (Resolution, R), also der Abstand zwischen zwei Peaks an der Basislinie, das wahrscheinlich aussagekräftigste Kriterium für die Güte einer Trennung Die Auflösung ist abhängig von der Kapazität (Stärke der Wechselwirkung, Maß: Retentionsfaktor k), von der Selektivität (unterschiedlich starke Wechselwirkungen zweier Substanzen, Maß: Trennfaktor α) und von der Trennleistung (Peakform, Maß: Bodenzahl, N) Ein wichtiger Trennmechanismus bei Biomolekülen (z. B. Proteine, monoklonale Antikörper) ist die Ausschlusschromatographie, SEC In der SEC basiert die Trennung auf unterschiedliche Molekülgrößen, eine Wechselwirkung findet definitionsgemäß gar nicht statt (sollte …). Somit entfallen bzgl. Auflösung hier zwei der drei möglichen Optimierungsparameter, nämlich  Kapazität und Selektivität. Das bedeutet: Man kann in der SEC eine genügend gute Trennung nur über eine Verbesserung der Trennleistung, d.h. über die Peakform erzielen. Somit konzentrieren sich die Bemühungen bei der Optimierung einer SEC-Methode erstens auf die Unterbindung von Wechselwirkungen…

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Woher kommt das – weitere Symptome

By A Fehlersuche, Allgemein, Fluss, Injektionsvolumen, Peakverbreiterung, pH-Wert des Eluenten, Totvolumen

Liebe Leser:innen, zunächst wünsche ich Ihnen ein gesundes, zufriedenes und erfolgreiches Jahr 2023. Im letzten HPLC-Tipp des Jahres 2022 hatte ich Ihnen die Kurztabelle „Symptome-Ursachen“ in der Routine-HPLC vorgestellt. In der zusätzlichen Spalte nun „Welches Symptom noch?“ finden Sie weitere Informationen, die man/frau dem Chromatogramm bzw. den Anzeigen am Gerät entnehmen kann. Diese helfen, die jeweilige Ursache(n) noch genauer zu spezifizieren bzw. noch mehr einzugrenzen.   Änderung (Symptom) Ursache(n) Welches Symptom noch? Kommentar ∆ A + ∆ H 1. ∆ Injektionsvolumen 2. Irreversible Adsorption (Physisorption, Memory-Effekt) 3. ∆ Detektor 4. Instabile Probe 5. ∆ pH-Wert 6. ∆ Probekonzentration                 5. ∆ Peakform 1. Neben Luft und verstopfte Nadel durch “Krümmelchen”, auch unpassende Ansaug- und/oder Injektionsgeschwindigkeit 2. … z. B. an einer Stahloberfläche (Stahlkapillare. Metallsiebchen) 3. Schwache Lampe, Belag in der Zelle 5. Eine ungewollte Änderung des pH-Wertes kann die UV-Absorption beeinflussen 6. Organisches Lösemittel kann bei ungekühltem Autosampler aus dem vial entweichen (anreichern der Probe) ∆ H + ∆ tR, A = konstant 1. Eluent 2. ∆ stationäre Phase 3. ∆ Temperatur 1. ∆ P     3. ∆ P Stets: t0 = konstant, bei isokratischen Trennungen in der Regel auch ∆ Peakform…

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Woher kommt das?

By A Fehlersuche, Bodenzahl, Detektor, Fluss, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Peakverbreiterung, pH-Wert des Eluenten, Pumpe, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Typischen Symptomen können bestimmten Ursachen zugeordnet werden; oder aber die Zahl der infrage kommenden Ursachen kann durch Beurteilung der Symptome („Welche Veränderung kann dieses Symptom bedingen und welche definitiv nicht?“) wenigstens eingegrenzt werden. Nachfolgend werden beispielhaft sieben häufige „Symptome-Ursachen“ in der Routine-HPLC vorgestellt. Bei Bedarf erfolgt auch ein Kommentar. Für die vorgestellten Fälle gelten folgende Annahmen: Keine bewusste Änderung seitens der Anwender:innen, z. B. es wurde keine längere Säule eingebaut Es handelt sich vorwiegend um RP-Trennungen mit einem konzentrationsempfindlichen Detektor wie beispielsweise UVVis, Diodenarray, Fluoreszenz- oder Brechungsindexdetektor Weiter unten sind die häufigsten Ursachen genannt Symbole: ∆: Änderung H: Peakhöhe A:…

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Probleme erst gegen Ende der Sequenz – mögliche Ursachen

By A Fehlersuche, HPLC-Tipps, Peakverbreiterung, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), Veränderung der Peakfläche, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Zu Beginn einer längeren Sequenz läuft alles bestens. Gegen Sequenz-Ende jedoch tauchen verstärkt Probleme auf, z. B. Geisterpeaks, Veränderung der Peakform und/oder der Peakfläche und nicht zuletzt Verschiebung der Retentionszeit. Welche Ursachen kommen in Frage? Die Lösung Es handelt sich hierbei wohl um Ursachen, die zeitabhängig sind. Nachfolgend eine Auswahl von Symptomen und möglichen Ursachen: Temperatur zum Ersten: Druck-, evtl. auch Peakfläche-Schwankungen Es finden manchmal aufgrund einer niedrigen Temperatur im Probengeber Nachfällungen statt, die erst später einsetzen und zu folgenden Problemen führen können: Verstopfung der Injektionsnadel, Niederschlag am Siebchen direkt am Säulenkopf usw. Vorgehen, um ein kommendes Problem…

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Gründe für eine Verschiebung des pH-Wertes

By A Fehlersuche, HPLC-Tipps, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), pH-Wert des Eluenten

Der Fall Eine unbeabsichtigte Verschiebung des pH-Wertes kann bei polaren Komponenten viel bewirken. Und das Risiko einer Verschiebung besteht dann, wenn der Mess-pH-Wert nahe dem pKS– bzw. pKB-Wert der betreffenden sauren bzw. basischen Komponente befindet. Es gibt kaum eine chromatographisch relevante Größe, die sich dabei nicht ändern kann: Retentionszeit, Peakform, Peakfläche, Nachweisgrenze, usw. Wir haben uns an dieser Stelle oft über die ein oder andere mögliche Ursache für eine Verschiebung des pH-Wertes unterhalten. Welche sind nun die wichtigsten? Die Lösung Nachfolgend stichwortartig die häufigsten Ursachen nach abnehmender Häufigkeit bzw. Relevanz Nach der Zugabe des organischen Lösungsmittels ändert sich der pH-Wert…

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Zwei kleine Sommer-Tipps

By A Fehlersuche, Auto-Sampler, Bodenzahl, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, kleine Peaks, Probengeber

Temperatur-Änderung – einige Konsequenzen „Funktionierendes“ Gerät – unterschiedliche Ergebnisse Temperatur   Passend zur Jahreszeit hier ein Hinweis bzgl. einer unbeabsichtigten Temperaturänderung. Eine solche ist gerade im Sommer (morgens-mittags) nicht ungewöhnlich. Zu was kann sie u. a. führen? Eine Temperaturänderung beeinflusst in der Regel die Selektivität wesentlich stärker als die Retentionszeit, siehe Abbildung 1. Sogar eine Abnahme der Temperatur um 10 °C führt zu einer Verschiebung der Retentionszeit lediglich von 22,17 auf 22,79 min. Die Selektivität ändert sich dagegen merklich: Antrennung im hinteren Bereich des Chromatogramms und 1 Peak im kritischen Bereich bei 20 °C vs. Basislinientrennung und 3 Peaks bei…

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Die „Kleinen“ im Sommer …

By Allgemein, Auflösung, B Optimierung, Bodenzahl, HPLC-Tipps, Probenlösungsmittel

1. „Schwach“ ist oft effektiver – im positiven oder im negativen Sinn 2. Auflösung bei einer RP-Trennung nicht vorhanden – effektive Maßnahmen   „Schwach“ ist oft effektiver – im positiven oder im negativen Sinn An schwachen Ionenaustauscher (WCX) werden sehr ähnliche ionische Komponenten häufig besser getrennt als an starken (SCX) Mit einer schwachen Probelösung(im RP-Modus: Jene einfach mit Wasser verdünnen oder mit Neutralsalz versetzen) erreicht man häufig eine Verbesserung der Peakform und somit der Auflösung, vor allem bei früh eluierenden Peaks Analog die mobile Phase: Ein schwächerer Eluent (im RP-Modus: Wasser-/Pufferreich) führt in der Regel zu einer besseren Trennung Eine schwächere Isopropanol/Wasser-Lösung (z. B….

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Zwei identische Anlagen, isokratischer Lauf, unterschiedliche Ergebnisse – mögliche Ursachen

By A Fehlersuche, Apparatur, Einstellparameter, HPLC-Tipps, Lebensdauer der Säule, Peakverbreiterung, Totvolumen

Der Fall Sie übernehmen eine isokratische HPLC-Methode; Ihre Anlage ist baugleich mit der Anlage an der die Methode entwickelt worden ist, die Prüfvorschrift ist recht ausführlich. Dennoch gibt es Probleme, z. B. Retentionszeit(en), Peakform- und/oder -fläche ist(sind) unterschiedlich, ferner: Die Säule hält nicht so lang. Was können die Ursachen sein? Die Lösung Erwartungsgemäß gibt es viele mögliche Gründe. Jene können u.a. grob in zwei Kategorien eingeteilt werden: 1. Es fehlen Details zum Handling bzw. zum Gerät 2. Unterschiede in der Handhabung apparativer „Feinheiten“ Nachfolgend werden einige typische Beispiele für beide Kategorien aufgeführt. Fehlende Detailangaben in der Prüfvorschrift/Methodenbeschreibung ∆ Integrationsalgorithmus, ∆…

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